Lambda核酸外切酶

Lambda核酸外切酶公司正在出售的產(chǎn)品：昆明白小鼠胚胎成纖維細胞，經(jīng)射線處理，P3,300萬細胞　碳酐相關(guān)蛋白8封閉多肽　新生隱球菌PCR檢測試劑盒　大鼠糖缺失性轉(zhuǎn)鐵蛋白(CDT) 試劑盒 ELISA　天冬酰胺合成（AS)活性比色法檢測試劑盒　沙福芽孢桿菌　β淀粉樣前體蛋白結(jié)合蛋白3抗體

公司產(chǎn)品僅供科研研究使用、不得用于臨床診斷！

作用于雙鏈 DNA，沿 5′→3′方向逐步切去 5′單核苷酸。最適底物是 5′磷酸化的雙鏈DNA，也能緩慢降解單鏈 DNA 和非磷酸化底物。該酶不能從 DNA 的切刻或缺口處起始消化。

活性定義：1 單位指在 50 μl 反應體系中，37℃條件下，30分鐘內(nèi)能從雙鏈 DNA 底物上催化產(chǎn)生 10 nmol 酸溶性脫氧核糖核苷酸所需的酶量。
使用注意事項
（1）1×Lambda Exo Buffer：67 mM Glycine-KOH（pH 9.4@ 25℃），2.5 mM MgCl2，50 μg/ml BSA，37℃溫育。
（2）該酶的最佳反應溫度為 37°C，75°C 10min 可失活。
（3）5′-0H 端的切割速度比 5′-PO4端慢 20 倍，單鏈 DNA 比雙鏈 DNA 慢 100 倍。
操作方法：
1.配置反應體系如下：
DNA 2~5 μg
10×Lambda Exo Buffer 5 μl
Lambda Exonuclease 1 μl
ddH2O upto 50 μl
2. 37℃反應 30min 。
3. 75℃ 10min 進行熱失活。

PCR 反應需要使用哪些試劑和設備？

試劑:
模板DNA：PCR反應需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；引物：PCR反應的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；dNTPs：PCR反應中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成等生物學過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；Taq DNA聚合酶：PCR反應需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；PCR buffer溶液：對PCR反應具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應特異性，從而提高反應效率；酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應產(chǎn)物；
設備：
PCR儀：用于控制反應溫度，保證PCR反應時不同溫度環(huán)節(jié)的嚴格控制；電泳槽：用于分離PCR擴增產(chǎn)物；核酸提取儀：從組織樣本中全自動提取核酸。  這些試劑和設備在PCR分子生物學技術(shù)中均是，只有在有序齊全的基礎上，才能進行PCR反應并得出準確結(jié)果。

PCR相關(guān)基礎實驗：

PCR反應基本步驟一般的聚合酶鏈式反應由20到35個循環(huán)組成，每個循環(huán)包括以下3個步驟：

一、變性：

利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個循環(huán)之前，通常加熱長一些時間以確保模板和引物分離，僅以單鏈形式存在。該步驟時間1-2分鐘，接下來PCR儀就控制溫度進入循環(huán)階段。

二、退火或稱接合,復性：

在DNA雙鏈分離后，降低溫度使得引物可以結(jié)合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點5℃。錯誤的退火溫度可能導致引物不與模板結(jié)合或者錯誤地結(jié)合。該步驟時間1-2分鐘。

三、延伸：

DNA聚合酶由降溫時結(jié)合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度。傳統(tǒng)的Taq估計合成1000bp/min、較新的Tbr（來自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒、商業(yè)公司生產(chǎn)的融合型聚合酶僅需約10-15秒。

PCR反應條件優(yōu)化：

1、變性溫度和時間：

保證模板DNA解鏈是保證整個PCR擴增成功的關(guān)鍵。加熱90~95°C, 30~60s，再復雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過高或高溫持續(xù)時間過長，可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害。

2、復性溫度和時間:

PCR擴增特異性取決于復性過程中引物與模板的結(jié)合。復性溫度越高，產(chǎn)物特異性越高。復性溫度越低，產(chǎn)物特異性越低。需根據(jù)引物的Tm值具體設定。

3、延伸溫度和時間:

一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個核苷酸時，過高的延伸溫度不利于引物與模板的結(jié)合，可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應時間，可根據(jù)待擴增片段的長度而定，小于1kb, 1min足夠；大于1kb需加長延伸時間。Taq酶可根據(jù)1kb/min增加時間。這里需要注意，延伸時間過長可能出現(xiàn)非特異擴增。因此需要設置恰到好處的延伸時間。

4、循環(huán)數(shù):

其他參數(shù)選定后，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20?25次循環(huán)后，PCR產(chǎn)物的積累即可達到最大值，實際操作中由于每步反應的產(chǎn)率不可能達到100%，因此不管模板濃度是多少，20~30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)越多，非特異擴增增加。

公司正在出售的產(chǎn)品：