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T4 DNA 連接酶

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參考價(jià)312
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35KU312元15 盒 可售
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更新時(shí)間:2024-01-12 16:20:41瀏覽次數(shù):667

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產(chǎn)品簡介

供貨周期 現(xiàn)貨 規(guī)格 35KU
貨號(hào) A-PJ1087 應(yīng)用領(lǐng)域 化工
主要用途 僅供科研研究實(shí)驗(yàn)    
T4 DNA 連接酶公司正在出售的產(chǎn)品:中華鱉肺成纖維細(xì)胞 鋅指蛋白187封閉多肽 中華枝睪吸蟲PCR檢測試劑盒 大鼠生長激釋放多肽(GHRP)ELISA檢測試劑盒 葡萄糖脫氫(GCDH)活性比色法檢測試劑盒 假交替單胞菌 19號(hào)染色體開放閱讀框18抗體

詳細(xì)介紹

商品屬性:

產(chǎn)品名稱

規(guī)格

貨號(hào)

T4 DNA 連接酶

35KU

A-PJ1087

QQ截圖20240110094643.jpg

描述:T4 DNA Ligase 可催化相鄰 DNA 鏈的 5’-P 末端和 3’-OH 末端以磷酸二酯鍵結(jié)合的反應(yīng),需 ATP 作輔酶,不僅 可以催化粘性末端之間或平滑末端之間的 DNA 的連接,也 可以催化 DNA 與 RNA 之間以及少數(shù) RNA 之間的連接???應(yīng)用于在粘性末端或平末端連接雙鏈 DNA 分子,也可應(yīng)用 于修補(bǔ)雙鏈 DNA、RNA 或 DNA RNA 雜交體上的缺口。

組分

儲(chǔ)存:-20°C 可保存 2 年。
活性定義:16°C 反應(yīng) 30 分鐘條件下,使 1pmol 的粘性末端
DNA 連接所需要的酶量定義為 1Unit。
失活:65°C,10 分鐘。
10×T4 Ligase Buffer:500 mM Tris-HCl, pH 7.5, 50 mMMgCl2, 25mM DTT, 5mM ATP.
操作方法
1. 按以下組分配制反應(yīng)體系
10×T4 Ligase Buffer 2 μl
載體 50 ng(0.2-1pmol)
插入片段 1-50 ng(0.2-10pmol)
T4 DNA Ligase(200 U/μl) 1 μl
ddH2O Up to 20 μl
注意:兩個(gè)片段的連接時(shí),通常載體與插入片段的摩爾比為1:3(但該比例并非絕對(duì)嚴(yán)謹(jǐn),在 1:1-1:10 范圍內(nèi)均可獲得理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果),提取根據(jù)片段大小與濃度,計(jì)算其摩爾濃度。
2. 如為粘末端連接反應(yīng), 22°C (16-37°C)連接 30min,連接產(chǎn)物直接用于轉(zhuǎn)化(或凍存于-20°C)。


65.jpg

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PCR基本步驟及注意事項(xiàng)?

一、實(shí)驗(yàn)原理

PCR是體外人工選擇性擴(kuò)增DNA的一種方法,它類似于生物體內(nèi)DNA的復(fù)制。在生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而體外PCR反應(yīng)同樣需要類似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設(shè)計(jì)的特定序列,實(shí)現(xiàn)對(duì)特定位置的擴(kuò)增;PCR Buffer提供一個(gè)反應(yīng)的緩沖環(huán)境;反應(yīng)過程同生物體內(nèi)一樣,DNA雙鏈打開,引物結(jié)合模板,延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內(nèi)靠DNA解旋酶解鏈,而在體外在通過控制反應(yīng)溫度實(shí)現(xiàn)的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈,在退火溫度處引物結(jié)合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反復(fù)重復(fù)此過程即可實(shí)現(xiàn)對(duì)特定片段DNA的大量擴(kuò)增。到第三循環(huán)開始才產(chǎn)生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子,進(jìn)一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍。

在擴(kuò)增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來呈指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺(tái)效應(yīng)。平臺(tái)期(Plateau)會(huì)使原先由于錯(cuò)配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增,達(dá)到較高水平。因此,應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù),在平臺(tái)期前結(jié)束反應(yīng), 減少非特異性產(chǎn)物。到達(dá)平臺(tái)期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式,主要包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產(chǎn)物,cDNA等,但不能為RNA。對(duì)于不同類型的模板,其主要不同在于預(yù)變性的時(shí)間以及模板的量。一般對(duì)于大的基因組DNA預(yù)變性時(shí)間10min足夠,質(zhì)粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預(yù)變性2min、PCR產(chǎn)物預(yù)變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA,但仍可做PCR的模板,只不過在第一輪循環(huán)時(shí)只有一個(gè)引物結(jié)合,合成另一條鏈。從第二輪開始,兩個(gè)引物均與特異位點(diǎn)結(jié)合,從而實(shí)現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進(jìn)行PCR擴(kuò)增,原因就在于實(shí)現(xiàn)PCR反應(yīng)的是DNA聚合酶,只能特意識(shí)別DNA鏈。

2.對(duì)于模版的量來說,一般25ul體系DNA的質(zhì)量為50—100ng。對(duì)于基因組DNA由于其結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜,提取的濃度也往往比較大,為防止?jié)舛冗^大對(duì)PCR造成影響,故需對(duì)提取的DNA進(jìn)行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會(huì)引起非特異性擴(kuò)增。對(duì)于質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物由于其結(jié)構(gòu)簡單,且提取濃度一般較低,則無需稀釋。

PCR實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該注意的問題有哪些?

沒有ct值

檢測結(jié)果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準(zhǔn));

2、PCR程序設(shè)置錯(cuò)誤,檢測熒光信號(hào)的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時(shí)采集,TaqMan法則一般在退火結(jié)束時(shí)或延伸時(shí)采集信號(hào),另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解。可通過PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據(jù)試劑盒說明書即可), 對(duì)未知濃度的樣本應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應(yīng)考慮樣本準(zhǔn)備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲(chǔ)備,避免反復(fù)凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內(nèi)含子,以確保擴(kuò)增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會(huì)影響擴(kuò)增)。

ct值過晚

在相對(duì)定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對(duì)定量中, 對(duì)低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會(huì)增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準(zhǔn)確。

因此,判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和目的進(jìn)行。

1、擴(kuò)增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進(jìn)行優(yōu)化;引物或探針設(shè)計(jì)不合理, 需要重新設(shè)計(jì);

2、PCR程序不合適, 改用三步法進(jìn)行反應(yīng), 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當(dāng)降低退火溫度; 退火/延伸時(shí)間短(可以在推薦的時(shí)間條件下延長10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產(chǎn)物太長。PCR產(chǎn)物設(shè)計(jì)超過500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進(jìn)行PCR檢測或?qū)⒛0暹M(jìn)行稀釋。

公司正在出售的產(chǎn)品:

諾如病毒G4型染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

白介1RαELISA試劑盒 IL-1Rα免費(fèi)代測試劑

禽副黏病毒(1型)探針法熒光定量RT-PCR試劑盒

網(wǎng)尾線蟲通用PCR檢測試劑盒說明書

蛋白L-異天冬氨-O-甲基轉(zhuǎn)移ELISA試劑盒 PCMT1免費(fèi)代測試劑

人支原體PCR檢測試劑盒說明書

河弧菌(VF)核檢測試劑盒

7α-羥化ELISA試劑盒

馬流感病毒H3N8PCR檢測試劑盒

艱難梭狀桿菌PCR檢測試劑盒

蛋白激抑制因子αELISA試劑盒

馬流產(chǎn)沙門氏菌染料法熒光定量PCR試劑盒

曼氏桿菌通用探針法熒光定量PCR試劑盒探針法熒光定量PCR試劑盒

凋亡抑制因子5ELISA試劑盒

致瀉性大腸桿菌通用探針法熒光定量PCR試劑盒

普通變形桿菌染料法熒光定量PCR試劑盒

短腭肺鼻腔上皮癌關(guān)聯(lián)蛋白2ELISA試劑盒

兔出血癥病毒通用型(RHDV)核檢測試劑盒

氣單胞菌PCR檢測試劑盒

多肽-N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移9ELISA試劑盒

禽白血病病毒H亞群染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

馬源性成分(Horse)核檢測試劑盒

二羥基賴正己氨ELISA試劑盒

鯉皰疹病毒2PCR試劑盒

馬隱秘桿菌PCR檢測試劑盒

泛蛋白DELISA試劑盒

諾卡菌通用探針法熒光定量PCR試劑盒

葡萄孢菌PCR檢測試劑盒供應(yīng)

紡錘體蛋白3ELISA試劑盒

馬類圓線蟲探針法熒光定量PCR試劑盒

淋球菌/沙眼衣原體/解脲脲原體PCR檢測試劑盒(熒光PCR法)

人蛋白水解誘導(dǎo)因子/皮離蛋白(PIF/DCD)ELISA試劑盒

禽白血病病毒PCR檢測試劑盒

牛莫拉氏菌PCR檢測試劑盒說明書

α半乳糖基抗體(Gal)檢測試劑盒elisa

革蘭氏陰性細(xì)菌通用染料法熒光定量PCR試劑盒

腸出血性大腸桿菌O104:H4血清型探針法熒光定量PCR試劑盒

人脫氫E1(PDH E1)試劑盒ELISA

蛙病毒PCR檢測試劑盒

鳥分枝桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒

β-防御3 試劑盒ELISA

T4 DNA 連接酶腸侵襲性大腸桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒

肉毒桿菌F型(CB-F)核檢測試劑盒

人雌激誘導(dǎo)蛋白PS2 試劑盒 ELISA

禽傳染性支氣管炎病毒荷蘭株PCR檢測試劑盒

 


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