9N 2.0 DNA連接酶

9N 2.0 DNA連接酶公司正在出售的產(chǎn)品：白化金黃地鼠肺成纖維細(xì)胞　糖皮質(zhì)激誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄蛋白1封閉多肽　溶組織梭狀芽孢桿菌PCR檢測試劑盒　大鼠嗜粒細(xì)胞趨化蛋白Eotaxin 1(Eotaxin 1/CCL11) ELISA Kit　羥自由基清除能力活性比色法檢測試劑盒　利福小單孢桿菌　傷寒沙菌沉默蛋白烏沙抗體

公司產(chǎn)品僅供科研研究使用、不得用于臨床診斷！

描述：9N 2.0 DNA 連接酶（又名 9 oN DNA Ligase）能夠催 化磷酸二酯鍵的形成，使與同一互補靶 DNA 鏈雜交的兩條 相鄰寡核苷酸鏈的 5′-磷酸末端和 3′-羥基末端通過磷酸二 酯 鍵 相 連 。 該 酶 來源于 極 度 耐 熱 的 海 底 超 嗜 熱 古 菌 （Thermococcus sp.）9°N 菌株中克隆的連接酶基因，在 45℃-90℃ 范圍內(nèi)均有活性。該酶進一步經(jīng)基因工程基因突 變，使得耐受更高的溫度，在 90℃孵育 15min 仍然保留 50% 以上的活性，因此其適用于：（1）高溫條件下，連接 DNA 鏈上的切刻位點；（2）與 PCR 反應(yīng)條件兼容可用連接酶檢 測反應(yīng)；（2）連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，對等位基因進行特異性檢測。 
組分

儲存：-20℃可保存 2 年。
活性定義：1 單位指 50μl 反應(yīng)體系中，45℃ 條件下，15 分
鐘內(nèi)能使 50% 的 1μg 經(jīng) BstEII 消化的 λDNA 片段（12
bp 粘性末端）發(fā)生連接所需要的酶量。
1X 9N DNA 連接酶反應(yīng)緩沖液
10 mM Tris-HCl，600μM ATP，2.5 mM MgCl2，2.5 mM
DTT，0.1% Triton X-100（pH 7.5 @ 25℃），45℃ 溫育。

PCR 反應(yīng)需要使用哪些試劑和設(shè)備？

試劑:
模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；引物：PCR反應(yīng)的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成等生物學(xué)過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；PCR buffer溶液：對PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；
設(shè)備：
PCR儀：用于控制反應(yīng)溫度，保證PCR反應(yīng)時不同溫度環(huán)節(jié)的嚴(yán)格控制；電泳槽：用于分離PCR擴增產(chǎn)物；核酸提取儀：從組織樣本中全自動提取核酸。  這些試劑和設(shè)備在PCR分子生物學(xué)技術(shù)中均是，只有在有序齊全的基礎(chǔ)上，才能進行PCR反應(yīng)并得出準(zhǔn)確結(jié)果。

PCR相關(guān)基礎(chǔ)實驗：

PCR反應(yīng)基本步驟一般的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)由20到35個循環(huán)組成，每個循環(huán)包括以下3個步驟：

一、變性：

利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個循環(huán)之前，通常加熱長一些時間以確保模板和引物分離，僅以單鏈形式存在。該步驟時間1-2分鐘，接下來PCR儀就控制溫度進入循環(huán)階段。

二、退火或稱接合,復(fù)性：

在DNA雙鏈分離后，降低溫度使得引物可以結(jié)合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點5℃。錯誤的退火溫度可能導(dǎo)致引物不與模板結(jié)合或者錯誤地結(jié)合。該步驟時間1-2分鐘。

三、延伸：

DNA聚合酶由降溫時結(jié)合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度。傳統(tǒng)的Taq估計合成1000bp/min、較新的Tbr（來自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒、商業(yè)公司生產(chǎn)的融合型聚合酶僅需約10-15秒。

PCR反應(yīng)條件優(yōu)化：

1、變性溫度和時間：

保證模板DNA解鏈?zhǔn)潜ＷC整個PCR擴增成功的關(guān)鍵。加熱90~95°C, 30~60s，再復(fù)雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過高或高溫持續(xù)時間過長，可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害。

2、復(fù)性溫度和時間:

PCR擴增特異性取決于復(fù)性過程中引物與模板的結(jié)合。復(fù)性溫度越高，產(chǎn)物特異性越高。復(fù)性溫度越低，產(chǎn)物特異性越低。需根據(jù)引物的Tm值具體設(shè)定。

3、延伸溫度和時間:

一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個核苷酸時，過高的延伸溫度不利于引物與模板的結(jié)合，可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應(yīng)時間，可根據(jù)待擴增片段的長度而定，小于1kb, 1min足夠；大于1kb需加長延伸時間。Taq酶可根據(jù)1kb/min增加時間。這里需要注意，延伸時間過長可能出現(xiàn)非特異擴增。因此需要設(shè)置恰到好處的延伸時間。

4、循環(huán)數(shù):

其他參數(shù)選定后，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20?25次循環(huán)后，PCR產(chǎn)物的積累即可達(dá)到最大值，實際操作中由于每步反應(yīng)的產(chǎn)率不可能達(dá)到100%，因此不管模板濃度是多少，20~30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)越多，非特異擴增增加。

公司正在出售的產(chǎn)品：