全血/血漿/血清總RNA提取試劑盒

全血/血漿/血清總RNA提取試劑盒公司正在出售的產(chǎn)品：團(tuán)頭魴尾鰭細(xì)胞　雷帕靶蛋白封閉多肽　雞傳染性貧血病毒PCR檢測試劑盒　大鼠三碘甲狀腺原氨(T3)ELISA試劑盒　內(nèi)切β1，4葡聚糖（Cx）活性比色法檢測試劑盒　生癌腸桿菌　16號染色體開放閱讀框61抗體

商品屬性：

該試劑盒是在 TRIzol LS 的基礎(chǔ)上改造而成，主要成分為 TRIzol LS 試劑。利用 TRIzol LS 中的高序鹽成分，可使 RNA 結(jié)合于硅膠膜上，通過漂洗、洗脫即可獲得高純度RNA。該試劑盒專門用于血液、血漿/血清、病毒液等液體樣品，可在最短的時間內(nèi)獲得高純度的 RNA。獲得的總 RNA純度高，沒有 DNA 和蛋白質(zhì)污染，適用于 RT-PCR、qRT-PCR、芯片分析、Northern Blot 等實驗。藍(lán)圖
(1) Washing Buffer（已含乙醇）勿需加無水乙醇，請直接使用。
(2) TRIzol LS 含有強變性劑，請勿直接于皮膚接觸或吞咽，若接觸到皮膚或眼睛請盡快到醫(yī)院處理。實驗時務(wù)必穿實驗服，戴手套。
儲存：2-8℃避光保存，可保存 2 年。

操作方法
1.取 250 μl 抗凝全血、血漿、血清、病毒液樣本（體積不足時，加水至 250 μl），加入至 750 μl TRIzol LS 試劑中，然后立即手腕用力上下顛倒混合均勻，靜置 5min；如樣本為糞便等固體樣品，可用 PBS 重懸樣品，并勻漿后，3000 rpm離心 5min，取上清作為病毒液樣品，操作同上。
2. 向上述溶液中加入 0.2 ml 氯仿，手腕用力振蕩 15s，室溫放置 2min。
3. 13000rpm 離心 5min，準(zhǔn)確吸取 0.5 ml（吸入過多或過少均影響回收率）無色上清至新的 1.5 ml EP 管中。
4. 向上述 0.5 ml 上清液中加入 0.3ml 異丙醇，手腕輕柔上下顛倒數(shù)次，并倒入吸附柱中，13000rpm 離心 15s。
5. 向吸附柱中加入 500 μl Washing Buffer，13000rpm 離心15s；重復(fù)此步驟一次。
6. 將吸附柱重新放回離心機，13000rpm 空離心 2min，將殘留的乙醇甩干。
7. 將吸附柱芯放入到 1.5 ml Nuclease Free 收集管中，向吸附柱芯中加入 20~50 μl Nuclease Free H2O，室溫放置 2min,13000rpm 離心 1min，洗脫液即為 RNA 產(chǎn)物，冷凍保存。

PCR基本步驟及注意事項？

一、實驗原理

PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法，它類似于生物體內(nèi)DNA的復(fù)制。在生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而體外PCR反應(yīng)同樣需要類似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設(shè)計的特定序列，實現(xiàn)對特定位置的擴增；PCR Buffer提供一個反應(yīng)的緩沖環(huán)境；反應(yīng)過程同生物體內(nèi)一樣，DNA雙鏈打開，引物結(jié)合模板，延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內(nèi)靠DNA解旋酶解鏈，而在體外在通過控制反應(yīng)溫度實現(xiàn)的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈，在退火溫度處引物結(jié)合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反復(fù)重復(fù)此過程即可實現(xiàn)對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環(huán)開始才產(chǎn)生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子，進(jìn)一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍。

在擴增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來呈指數(shù)擴增的反應(yīng)變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺效應(yīng)。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴增，達(dá)到較高水平。因此，應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺期前結(jié)束反應(yīng)， 減少非特異性產(chǎn)物。到達(dá)平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式，主要包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產(chǎn)物，cDNA等，但不能為RNA。對于不同類型的模板，其主要不同在于預(yù)變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預(yù)變性時間10min足夠，質(zhì)粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預(yù)變性2min、PCR產(chǎn)物預(yù)變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA，但仍可做PCR的模板，只不過在第一輪循環(huán)時只有一個引物結(jié)合，合成另一條鏈。從第二輪開始，兩個引物均與特異位點結(jié)合，從而實現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進(jìn)行PCR擴增，原因就在于實現(xiàn)PCR反應(yīng)的是DNA聚合酶，只能特意識別DNA鏈。

2.對于模版的量來說，一般25ul體系DNA的質(zhì)量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，提取的濃度也往往比較大，為防止?jié)舛冗^大對PCR造成影響，故需對提取的DNA進(jìn)行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增。對于質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物由于其結(jié)構(gòu)簡單，且提取濃度一般較低，則無需稀釋。

PCR實驗中應(yīng)該注意的問題有哪些?

沒有ct值

檢測結(jié)果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準(zhǔn));

2、PCR程序設(shè)置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結(jié)束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解。可通過PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據(jù)試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應(yīng)考慮樣本準(zhǔn)備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復(fù)凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內(nèi)含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

ct值過晚

在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準(zhǔn)確。

因此,判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實驗設(shè)計和目的進(jìn)行。

1、擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進(jìn)行優(yōu)化;引物或探針設(shè)計不合理, 需要重新設(shè)計;

2、PCR程序不合適, 改用三步法進(jìn)行反應(yīng), 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當(dāng)降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產(chǎn)物太長。PCR產(chǎn)物設(shè)計超過500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進(jìn)行PCR檢測或?qū)⒛０暹M(jìn)行稀釋。

公司正在出售的產(chǎn)品：