詳細(xì)介紹
商品屬性:
產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 | 貨號(hào) |
2XRAPA3G全能PCR Mix | 1ml | A-PJ1031 |
2XRAPA3G全能PCR Mix | 10ml | A-PJ1031 |
RAPA3G DNA聚合酶為經(jīng)電子重構(gòu)架的第三代Taq DNA聚合酶,第三代DNA聚合酶具有高度的雜質(zhì)耐受性、長片段擴(kuò)增能力、高擴(kuò)增成功率、高產(chǎn)量等特征,從而使得RAPA3G系列產(chǎn)品可用于粗制樣品的直接擴(kuò)增,無需核酸純化步驟。雜質(zhì)耐受性方面,該酶可耐受植物中的多糖多酚;全血、血清、血漿中的肝素、高濃度的血紅蛋白、甘油三脂;乙醇;胍鹽;SDS等強(qiáng)PCR抑制劑。在血液直擴(kuò)PCR實(shí)驗(yàn)中,RAPA3G PCR Mix性能與KAPA3G DNA聚合酶展現(xiàn)出同等的表現(xiàn),其性能表現(xiàn)優(yōu)于二代聚合酶(血液擴(kuò)增Hemo KlenTaq Mix)。在植物直擴(kuò)PCR實(shí)驗(yàn)中,RAPA3G PCR Mix在配合DNA釋放劑的條件下與KAPA3G Plant PCR試劑盒性能一致。長片段擴(kuò)增能力方面,使用該酶可輕松擴(kuò)增8kb的基因組片段,20kb的λ DNA,8kb的cDNA。該酶具有6kb/min以上的擴(kuò)增速度,可顯著的縮短PCR的擴(kuò)增時(shí)間,在常規(guī)測試條件下,10s的延伸時(shí)間可完成1kb的基因組DNA擴(kuò)增。在PCR擴(kuò)增成功率方面,與其它類型的PCR擴(kuò)增試劑對比中,RAPA3G PCR Mix表現(xiàn)出的PCR擴(kuò)增成功率。此外,該酶包含一定比例的RAPA HiFi超保真DNA聚合酶,因此其具有一定的保真性能(經(jīng)藍(lán)白斑測試,其保真性能約為Taq DNA聚合酶的56倍)。另外,RAPA3G系列產(chǎn)品均采用專有的熱啟動(dòng)技術(shù),確保50°C以下無活性,僅有95°C加熱5min以后才能恢復(fù)其活性,因此可最大限度的提高擴(kuò)增的特異性,減少非特異性產(chǎn)物的產(chǎn)生。該P(yáng)CR Mix具有5'-3'的聚合酶活性、5'-3'的外切酶活性和3'-5'的外切酶活性,產(chǎn)物部分帶有"A"尾巴,部分為平末端,因此產(chǎn)物均可用于TA克隆或平端克隆。 | ||||||||||||||||||||||||||
特征和用途 | ||||||||||||||||||||||||||
| ||||||||||||||||||||||||||
RAPA3G DNA聚合酶對抑制物耐受性 | ||||||||||||||||||||||||||
| ||||||||||||||||||||||||||
50μl體積建議添加的樣品量 | ||||||||||||||||||||||||||
| ||||||||||||||||||||||||||
儲(chǔ)存 | ||||||||||||||||||||||||||
長期儲(chǔ)存置于-20°C以下,可保存2年,避免反復(fù)凍融;短期使用置于4°C(3個(gè)月)保存,一經(jīng)融化后請放置于4°C,勿再凍存。 | ||||||||||||||||||||||||||
反應(yīng)實(shí)例 | ||||||||||||||||||||||||||
1. 模板適應(yīng)性強(qiáng),長片段和短片段都可有效擴(kuò)增 | ||||||||||||||||||||||||||
Lane 1:λDNA 500bp, 2:λDNA 1kb, 3:λDNA 2kb, 4:λDNA 5kb, 5:λDNA 8kb, 6:λDNA 15kb, 7:λDNA 20kb, 8:human 500bp ,9:human 1kb, 10:human 2kb ,11:human 5kb, 12:human 8kb, 13:cDNA 166bp, 14:cDNA 552bp, 15:cDNA 960bp, 16:cDNA 1574bp, 17:cDNA 1705bp, 18:cDNA 2755b,p 19:cDNA 4128bp, 20:cDNA 7600bp, M:DNA Marker 10000 | ||||||||||||||||||||||||||
選取三種DNA模板,使用RAPA3G PCR Mix進(jìn)行擴(kuò)增,循環(huán)數(shù)統(tǒng)一為28 cycles,結(jié)果如上圖所示,對于不同種類DNA模板和不同長度的靶基因,RAPA3G PCR Mix均有良好的擴(kuò)增性能。 | ||||||||||||||||||||||||||
2. 對于粗制樣品DNA具有的耐受性 | ||||||||||||||||||||||||||
分別以人全血、血清、葉片粗制品DNA以及大豆種子粗制品DNA為模板,使用RAPA3G PCR Mix進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果如上圖展示,各種粗制樣品都有良好的擴(kuò)增,其中全血和血清可耐受15%。 | ||||||||||||||||||||||||||
3.擴(kuò)增靈敏度高,λDNA模板低至0.1pg也可以有效擴(kuò)增 | ||||||||||||||||||||||||||
以λDNA為模板,選取不同模板使用量,采用RAPA3G PCR Mix進(jìn)行擴(kuò)增2kb靶基因,循環(huán)數(shù)統(tǒng)一為28 cycles,結(jié)果如上圖所示,λDNA模板低至0.1pg也可以有效擴(kuò)增 |
PCR基本步驟及注意事項(xiàng)?
一、實(shí)驗(yàn)原理
PCR是體外人工選擇性擴(kuò)增DNA的一種方法,它類似于生物體內(nèi)DNA的復(fù)制。在生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而體外PCR反應(yīng)同樣需要類似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設(shè)計(jì)的特定序列,實(shí)現(xiàn)對特定位置的擴(kuò)增;PCR Buffer提供一個(gè)反應(yīng)的緩沖環(huán)境;反應(yīng)過程同生物體內(nèi)一樣,DNA雙鏈打開,引物結(jié)合模板,延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內(nèi)靠DNA解旋酶解鏈,而在體外在通過控制反應(yīng)溫度實(shí)現(xiàn)的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈,在退火溫度處引物結(jié)合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反復(fù)重復(fù)此過程即可實(shí)現(xiàn)對特定片段DNA的大量擴(kuò)增。到第三循環(huán)開始才產(chǎn)生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子,進(jìn)一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍。
在擴(kuò)增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來呈指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺(tái)效應(yīng)。平臺(tái)期(Plateau)會(huì)使原先由于錯(cuò)配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增,達(dá)到較高水平。因此,應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù),在平臺(tái)期前結(jié)束反應(yīng), 減少非特異性產(chǎn)物。到達(dá)平臺(tái)期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。
二、主要的成分
1.模板可以是多種形式,主要包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產(chǎn)物,cDNA等,但不能為RNA。對于不同類型的模板,其主要不同在于預(yù)變性的時(shí)間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預(yù)變性時(shí)間10min足夠,質(zhì)粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預(yù)變性2min、PCR產(chǎn)物預(yù)變性2min即可。
注意cDNA為單鏈DNA,但仍可做PCR的模板,只不過在第一輪循環(huán)時(shí)只有一個(gè)引物結(jié)合,合成另一條鏈。從第二輪開始,兩個(gè)引物均與特異位點(diǎn)結(jié)合,從而實(shí)現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進(jìn)行PCR擴(kuò)增,原因就在于實(shí)現(xiàn)PCR反應(yīng)的是DNA聚合酶,只能特意識(shí)別DNA鏈。
2.對于模版的量來說,一般25ul體系DNA的質(zhì)量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜,提取的濃度也往往比較大,為防止?jié)舛冗^大對PCR造成影響,故需對提取的DNA進(jìn)行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會(huì)引起非特異性擴(kuò)增。對于質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物由于其結(jié)構(gòu)簡單,且提取濃度一般較低,則無需稀釋。
PCR實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該注意的問題有哪些?
沒有ct值
檢測結(jié)果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問題:
1、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準(zhǔn));
2、PCR程序設(shè)置錯(cuò)誤,檢測熒光信號(hào)的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時(shí)采集,TaqMan法則一般在退火結(jié)束時(shí)或延伸時(shí)采集信號(hào),另外熒光采集是否選中;
3、引物或探針降解??赏ㄟ^PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;
4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據(jù)試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應(yīng)考慮樣本準(zhǔn)備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲(chǔ)備,避免反復(fù)凍融;
5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內(nèi)含子,以確保擴(kuò)增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會(huì)影響擴(kuò)增)。
ct值過晚
在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會(huì)增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準(zhǔn)確。
因此,判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和目的進(jìn)行。
1、擴(kuò)增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進(jìn)行優(yōu)化;引物或探針設(shè)計(jì)不合理, 需要重新設(shè)計(jì);
2、PCR程序不合適, 改用三步法進(jìn)行反應(yīng), 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當(dāng)降低退火溫度; 退火/延伸時(shí)間短(可以在推薦的時(shí)間條件下延長10s);
3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足;
4、PCR產(chǎn)物太長。PCR產(chǎn)物設(shè)計(jì)超過500bp;
5、模板中存在抑制物。用高純度模板進(jìn)行PCR檢測或?qū)⒛0暹M(jìn)行稀釋。
公司正在出售的產(chǎn)品:
曲霉屬通用染料法熒光定量PCR試劑盒 | 丙酰羧化β多肽ELISA試劑盒 PCCB免費(fèi)代測試劑 | 鸚鵡熱衣原體染料法熒光定量PCR試劑盒 |
梭狀桿菌屬通用PCR檢測試劑盒供應(yīng) | 促睡眠肽ELISA試劑盒 DSIP免費(fèi)代測試劑 | 勞森菌通用PCR檢測試劑盒直銷 |
傳染性胸膜肺炎放線桿菌(APP)核檢測試劑盒 | 表皮細(xì)胞活化肽因子ELISA試劑盒 | 貓白血病毒PCR檢測試劑盒 |
肺炎支原體熒光定量PCR檢測試劑盒(染料法) | 單純皰疹病毒Ⅰ型ELISA試劑盒 | 貓傳染性腹膜炎病毒(貓傳腹病毒)染料法熒光定量PCR試劑盒 |
馬立克氏病病毒1型探針法熒光定量PCR試劑盒 | 蛋白酪氨磷樣蛋白AELISA試劑盒 | 新生隱球菌探針法熒光定量PCR試劑盒 |
禽傳染性支氣管炎病毒Ark型染料法熒光定量RT-PCR試劑盒 | 抵抗樣分子βELISA試劑盒 | 豬藍(lán)耳病病毒通用型(PRRSV-U)核檢測試劑盒 |
禽結(jié)核分枝桿菌PCR檢測試劑盒 | 兜甲蛋白ELISA試劑盒 | 葡萄狀穗霉屬通用染料法熒光定量PCR試劑盒 |
馬立克氏病病毒2型探針法熒光定量PCR試劑盒 | 多巴色異構(gòu)ELISA試劑盒 | 流感病毒H2亞型PCR檢測試劑盒(熒光PCR法) |
馬疹病病毒探針法熒光定量PCR試劑盒 | 耳蝶呤2ELISA試劑盒 | 牛呼腸孤病毒染料法熒光定量RT-PCR 試劑盒 |
禽波氏桿菌PCR檢測試劑盒直銷 | 泛連接E3AELISA試劑盒 | 麥類條斑病菌PCR試劑盒 |
梨孢鐮刀菌探針法熒光定量PCR試劑盒 | 人肺表面活性蛋白D(SP-D)試劑盒ELISA | 皮炎芽生菌探針法熒光定量PCR試劑盒 |
諾如病毒Ⅰ型 / Ⅱ型 / Ⅳ型核檢測試劑盒( 三重?zé)晒?PCR 法 ) | 人二磷尿核苷葡糖醛基轉(zhuǎn)移2家族肽B4(UGT2B4)elisa試劑盒 | 三線鐮刀菌探針法熒光定量PCR試劑盒 |
腦膜炎敗血伊麗莎白菌探針法熒光定量qPCR試劑盒 | 人催產(chǎn)受體(OXTR)ELISA檢測試劑盒 | 魏氏無綠藻探針法熒光定量PCR試劑盒 |
小孢子菌屬通用PCR檢測試劑盒 | 人αL巖藻糖苷(AFU)ELISA試劑盒 | 2XRAPA3G全能PCR Mix漏斗狀帶絳蟲探針法熒光定量PCR試劑盒 |
口蹄疫病毒O型(FMDV-O)核檢測試劑盒 | 人不耐熱腸毒B亞單位(LTB) 試劑盒 ELISA | 普羅威登斯菌通用PCR檢測試劑盒 |