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上海撫生實(shí)業(yè)有限公司>>PCR相關(guān)試劑>>PCR相關(guān)>>2XRAPA3G全能PCR Mix

2XRAPA3G全能PCR Mix

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參考價(jià)234-1872
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1ml 234元15 盒 可售
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更新時(shí)間:2024-01-12 14:55:08瀏覽次數(shù):578

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產(chǎn)品簡介

供貨周期 現(xiàn)貨 規(guī)格 1ml、10ml
貨號(hào) A-PJ1031 應(yīng)用領(lǐng)域 化工
主要用途 公司產(chǎn)品僅用于科研    
2XRAPA3G全能PCR Mix公司正在出售的產(chǎn)品:敘利亞倉鼠細(xì)胞系 鳥苷環(huán)化激活蛋白1封閉多肽 牛病毒性腹瀉病毒型PCR檢測試劑盒 大鼠牛小腸堿性磷(CIAP)ELISA Kit 甲醛脫氫(FDH)活性比色法檢測試劑盒 燦爛弧菌 己糖6磷脫氫抗體

詳細(xì)介紹

商品屬性:

產(chǎn)品名稱

規(guī)格

貨號(hào)

2XRAPA3G全能PCR Mix

1ml

A-PJ1031

2XRAPA3G全能PCR Mix

10ml

A-PJ1031

RAPA3G DNA聚合酶為經(jīng)電子重構(gòu)架的第三代Taq DNA聚合酶,第三代DNA聚合酶具有高度的雜質(zhì)耐受性、長片段擴(kuò)增能力、高擴(kuò)增成功率、高產(chǎn)量等特征,從而使得RAPA3G系列產(chǎn)品可用于粗制樣品的直接擴(kuò)增,無需核酸純化步驟。雜質(zhì)耐受性方面,該酶可耐受植物中的多糖多酚;全血、血清、血漿中的肝素、高濃度的血紅蛋白、甘油三脂;乙醇;胍鹽;SDS等強(qiáng)PCR抑制劑。在血液直擴(kuò)PCR實(shí)驗(yàn)中,RAPA3G PCR Mix性能與KAPA3G DNA聚合酶展現(xiàn)出同等的表現(xiàn),其性能表現(xiàn)優(yōu)于二代聚合酶(血液擴(kuò)增Hemo KlenTaq Mix)。在植物直擴(kuò)PCR實(shí)驗(yàn)中,RAPA3G PCR Mix在配合DNA釋放劑的條件下與KAPA3G Plant PCR試劑盒性能一致。QQ截圖20240110094643.jpg長片段擴(kuò)增能力方面,使用該酶可輕松擴(kuò)增8kb的基因組片段,20kb的λ DNA,8kb的cDNA。該酶具有6kb/min以上的擴(kuò)增速度,可顯著的縮短PCR的擴(kuò)增時(shí)間,在常規(guī)測試條件下,10s的延伸時(shí)間可完成1kb的基因組DNA擴(kuò)增。在PCR擴(kuò)增成功率方面,與其它類型的PCR擴(kuò)增試劑對比中,RAPA3G PCR Mix表現(xiàn)出的PCR擴(kuò)增成功率。此外,該酶包含一定比例的RAPA HiFi超保真DNA聚合酶,因此其具有一定的保真性能(經(jīng)藍(lán)白斑測試,其保真性能約為Taq DNA聚合酶的56倍)。另外,RAPA3G系列產(chǎn)品均采用專有的熱啟動(dòng)技術(shù),確保50°C以下無活性,僅有95°C加熱5min以后才能恢復(fù)其活性,因此可最大限度的提高擴(kuò)增的特異性,減少非特異性產(chǎn)物的產(chǎn)生。該P(yáng)CR Mix具有5'-3'的聚合酶活性、5'-3'的外切酶活性和3'-5'的外切酶活性,產(chǎn)物部分帶有"A"尾巴,部分為平末端,因此產(chǎn)物均可用于TA克隆或平端克隆。

特征和用途

  • 快速擴(kuò)增:具有6kb/min的擴(kuò)增能力,1kb片段可在25min內(nèi)完成擴(kuò)增.

  • 高成功率擴(kuò)增:RAPA3G PCR Mix具有最高的PCR擴(kuò)增成功率。

  • 液體樣品直接擴(kuò)增:全血、血清、培養(yǎng)細(xì)胞、尿液等樣本直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增,無需核酸純化。

  • 組織樣本直接擴(kuò)增:葉片、種子、果實(shí)、動(dòng)物組織等樣品,可以直接擴(kuò)增,也可采用DNA釋放劑簡單處理后直接擴(kuò)增,無需核酸純化。

  • 長片段擴(kuò)增:質(zhì)粒、λ DNA 等簡單模板可以有效擴(kuò)增>20 kb,基因組可以有效擴(kuò)增>8 kb,cDNA可以有效擴(kuò)增>8kb。

  • 高保真擴(kuò)增:保真度是 Taq DNA Polymerase 的56 倍。

  • 高特異性:采用專有熱啟動(dòng)技術(shù),50°C以下無活性,僅有95°C加熱5min才能恢復(fù)酶活。

RAPA3G DNA聚合酶對抑制物耐受性

SDS0.01%胍鹽0.25%
乙醇5%全血15%
肝素0.1IU/ml血清15%
Trizol0.5%血漿2%
血紅蛋白30μM尿液5%

50μl體積建議添加的樣品量

抗凝全血2.5 μl培養(yǎng)細(xì)胞>100個(gè)
血清2.5 μl組織0.1mg
尿液2.5 μl毛發(fā)囊1-3個(gè)
血漿1 μlgDNA

1-400ng

植物葉片2mmcDNA1-400ng
植物粗提物2-4 μl質(zhì)粒0.1-10ng

儲(chǔ)存

長期儲(chǔ)存置于-20°C以下,可保存2年,避免反復(fù)凍融;短期使用置于4°C(3個(gè)月)保存,一經(jīng)融化后請放置于4°C,勿再凍存。

反應(yīng)實(shí)例

1. 模板適應(yīng)性強(qiáng),長片段和短片段都可有效擴(kuò)增

Lane 1:λDNA 500bp, 2:λDNA 1kb, 3:λDNA 2kb, 4:λDNA 5kb, 5:λDNA 8kb, 6:λDNA 15kb, 7:λDNA 20kb, 8:human 500bp ,9:human 1kb, 10:human 2kb ,11:human 5kb, 12:human 8kb, 13:cDNA 166bp, 14:cDNA 552bp, 15:cDNA 960bp, 16:cDNA 1574bp, 17:cDNA 1705bp, 18:cDNA 2755b,p 19:cDNA 4128bp, 20:cDNA 7600bp, M:DNA Marker 10000
選取三種DNA模板,使用RAPA3G PCR Mix進(jìn)行擴(kuò)增,循環(huán)數(shù)統(tǒng)一為28 cycles,結(jié)果如上圖所示,對于不同種類DNA模板和不同長度的靶基因,RAPA3G PCR Mix均有良好的擴(kuò)增性能。
2. 對于粗制樣品DNA具有的耐受性



分別以人全血、血清、葉片粗制品DNA以及大豆種子粗制品DNA為模板,使用RAPA3G PCR Mix進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果如上圖展示,各種粗制樣品都有良好的擴(kuò)增,其中全血和血清可耐受15%。

3.擴(kuò)增靈敏度高,λDNA模板低至0.1pg也可以有效擴(kuò)增




以λDNA為模板,選取不同模板使用量,采用RAPA3G PCR Mix進(jìn)行擴(kuò)增2kb靶基因,循環(huán)數(shù)統(tǒng)一為28 cycles,結(jié)果如上圖所示,λDNA模板低至0.1pg也可以有效擴(kuò)增



65.jpg

67.jpg


PCR基本步驟及注意事項(xiàng)?

一、實(shí)驗(yàn)原理

PCR是體外人工選擇性擴(kuò)增DNA的一種方法,它類似于生物體內(nèi)DNA的復(fù)制。在生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而體外PCR反應(yīng)同樣需要類似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設(shè)計(jì)的特定序列,實(shí)現(xiàn)對特定位置的擴(kuò)增;PCR Buffer提供一個(gè)反應(yīng)的緩沖環(huán)境;反應(yīng)過程同生物體內(nèi)一樣,DNA雙鏈打開,引物結(jié)合模板,延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內(nèi)靠DNA解旋酶解鏈,而在體外在通過控制反應(yīng)溫度實(shí)現(xiàn)的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈,在退火溫度處引物結(jié)合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反復(fù)重復(fù)此過程即可實(shí)現(xiàn)對特定片段DNA的大量擴(kuò)增。到第三循環(huán)開始才產(chǎn)生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子,進(jìn)一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍。

在擴(kuò)增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來呈指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺(tái)效應(yīng)。平臺(tái)期(Plateau)會(huì)使原先由于錯(cuò)配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增,達(dá)到較高水平。因此,應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù),在平臺(tái)期前結(jié)束反應(yīng), 減少非特異性產(chǎn)物。到達(dá)平臺(tái)期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式,主要包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產(chǎn)物,cDNA等,但不能為RNA。對于不同類型的模板,其主要不同在于預(yù)變性的時(shí)間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預(yù)變性時(shí)間10min足夠,質(zhì)粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預(yù)變性2min、PCR產(chǎn)物預(yù)變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA,但仍可做PCR的模板,只不過在第一輪循環(huán)時(shí)只有一個(gè)引物結(jié)合,合成另一條鏈。從第二輪開始,兩個(gè)引物均與特異位點(diǎn)結(jié)合,從而實(shí)現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進(jìn)行PCR擴(kuò)增,原因就在于實(shí)現(xiàn)PCR反應(yīng)的是DNA聚合酶,只能特意識(shí)別DNA鏈。

2.對于模版的量來說,一般25ul體系DNA的質(zhì)量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜,提取的濃度也往往比較大,為防止?jié)舛冗^大對PCR造成影響,故需對提取的DNA進(jìn)行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會(huì)引起非特異性擴(kuò)增。對于質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物由于其結(jié)構(gòu)簡單,且提取濃度一般較低,則無需稀釋。

PCR實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該注意的問題有哪些?

沒有ct值

檢測結(jié)果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準(zhǔn));

2、PCR程序設(shè)置錯(cuò)誤,檢測熒光信號(hào)的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時(shí)采集,TaqMan法則一般在退火結(jié)束時(shí)或延伸時(shí)采集信號(hào),另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解??赏ㄟ^PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據(jù)試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應(yīng)考慮樣本準(zhǔn)備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲(chǔ)備,避免反復(fù)凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內(nèi)含子,以確保擴(kuò)增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會(huì)影響擴(kuò)增)。

ct值過晚

在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會(huì)增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準(zhǔn)確。

因此,判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和目的進(jìn)行。

1、擴(kuò)增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進(jìn)行優(yōu)化;引物或探針設(shè)計(jì)不合理, 需要重新設(shè)計(jì);

2、PCR程序不合適, 改用三步法進(jìn)行反應(yīng), 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當(dāng)降低退火溫度; 退火/延伸時(shí)間短(可以在推薦的時(shí)間條件下延長10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產(chǎn)物太長。PCR產(chǎn)物設(shè)計(jì)超過500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進(jìn)行PCR檢測或?qū)⒛0暹M(jìn)行稀釋。

公司正在出售的產(chǎn)品:

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