RAPA3G動物組織直擴PCR試劑盒

RAPA3G動物組織直擴PCR試劑盒公司正在出售的產(chǎn)品：人肝癌細胞　視神經(jīng)相關(guān)蛋白1封閉多肽　鰓霉屬通用PCR檢測試劑盒　大鼠皮質(zhì)酮/腎上腺酮(CORT)ELISA Kit　堿性木聚糖活性比色法檢測試劑盒/堿性半纖維活性比色法檢測試劑盒　歐文斯氏弧菌　1號染色體開放閱讀框51抗體

公司產(chǎn)品僅供科研研究使用、不得用于臨床診斷！

RAPA3G DNA 聚合酶為經(jīng)電子重構(gòu)架的第三代 Taq DNA 聚合酶，第三代 DNA 聚合酶具有高度的雜質(zhì)耐受性、 長片段擴增能力、高擴增成功率、高產(chǎn)量，這些特點使得 RAPA3G 系列產(chǎn)品可用于粗制樣品的直接擴增，無需核酸純 化步驟。該 PCR Mix 具有 5’-3’的聚合酶活性、5’-3’的外切 酶活性、3’-5’的外切酶活性，產(chǎn)物部分帶有"A“尾巴，部 分為平末端，因此產(chǎn)物可用于 TA 克隆或平端克隆。

特點和用途：
（1）高雜質(zhì)耐受性：該 PCR Mix 可直接使用血液、蛋白含量較高的動物組織材料進行 PCR 擴增，無需基因組提取。
（2）高效的快速 DNA 釋放劑：盡管該 PCR Mix 可以直接使用組織細胞材料進行擴增，但我們?nèi)匀煌扑]采用 DNA 釋放劑進行樣本的快速前處理（約需要 5min，可高通量操作）。DNA 釋放劑的前處理，使得制備的 DNA 模板可以進行多次、多基因擴增，并長期保存 DNA，經(jīng) DNA 釋放劑處理的樣本，在室溫條件下放置 1 個月，無任何后續(xù)影響，-20 可長期保存。
（3）快速 PCR：該酶具有 6kb/min 以上的擴增速度，可顯著的縮短 PCR 的擴增時間，在常規(guī)測試條件下，10s 的延伸時間可完成 1kb 的基因組 DNA 擴增。
（4）粗制樣品的擴增能力：擴增能力>4kb。
（5）高保真性能：該制品包含一定比例的 RAPA HiFi 超保真 DNA 聚合酶，因此其具有一定的保真性能（經(jīng)藍白斑測試，其保真性能約為 Taq DNA 聚合酶的 56 倍）。
（6）熱啟動，防止非特異性擴增：RAPA3G 系列產(chǎn)品均采用  專有的熱啟動技術(shù)，確保 50 度以下無活性，僅有 95 度加熱 5min 以后才能恢復(fù)其活性，因此可最大限度的提高擴增的特異性，減少非特異性產(chǎn)物的產(chǎn)生。
包裝：
2×RAPA3G PCR Mix (with Dye) 1ml×2
快速 DNA 釋放劑 A 20 ml
快速 DNA 釋放劑 B 20 ml
儲存：長期儲存置于-20°C 以下，可保存 2 年；短期使用置于 4°C（3 個月）保存。
使用方法
1. DNA 釋放
（1）采用加熱法：取 2-10 個毛發(fā)囊、1-10mg 動物組織等材料，放入到 0.2ml EP 管中，加入 50 μl 快速 DNA 釋放劑A，于 PCR 儀中 98°C 加熱 5min，加熱完畢后加入 50 μl快速 DNA 釋放劑 B，混合均勻，即可使用。
（2）采用鋼珠研磨法：取 1-10mg 動物組織等材料，放入到 2ml EP 管中，加入 250 μl 快速 DNA 釋放劑 A 和 2-3 粒鋼珠，研磨 1-2min 成漿體裝。研磨完畢后加入 250 μl 快速DNA 釋放劑 B，混合均勻，即可使用。
2. 按下表配制 PCR 反應(yīng)體系并混合均勻：
2×RAPA3G PCR Mix (with Dye) 25 μl
上游引物(10 μM) 2 μl
下游引物(10 μM) 2 μl
步驟 1 制備的模板 DNA 2 μl
ddH2O 19 μl
注意：當(dāng)擴增片段>5kb 時，引物用量調(diào)整為 0.25-0.5μl。
3. PCR 擴增循環(huán)參數(shù)
循環(huán)數(shù) 溫度 時間
預(yù)變性 95°C 5min
25-40 Cycles
95°C 20s
50~60°C 20s
72°C 4-6kb/min
末延伸 72°C 2min
請注意：（1）該制品為熱啟動制品預(yù)變性步驟 5min 不可縮短，否則 DNA 聚合酶無法恢復(fù)活性。（2）當(dāng)擴增片段<1kb時，延伸時間使用 1-2kb="" 2-3kb="">3kb 時，請按照 2kb/min 的延伸時間進行設(shè)置。(3)盡管該酶具有 6kb/min 的延伸速度，但按照 2kb/min 設(shè)置延伸時間的條件下，能獲得最高的產(chǎn)量。
3. 注意事項：(1) 當(dāng)模板 GC 含量>70%時，請?zhí)砑?× Q-Solution。(2)當(dāng)采用全血、血漿等蛋白含量的樣本時，擴增完畢后可能會有變性的蛋白沉淀，請離心后再進行點樣和電泳。

PCR 反應(yīng)需要使用哪些試劑和設(shè)備？

試劑:
模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；引物：PCR反應(yīng)的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成等生物學(xué)過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；PCR buffer溶液：對PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；
設(shè)備：
PCR儀：用于控制反應(yīng)溫度，保證PCR反應(yīng)時不同溫度環(huán)節(jié)的嚴(yán)格控制；電泳槽：用于分離PCR擴增產(chǎn)物；核酸提取儀：從組織樣本中全自動提取核酸。  這些試劑和設(shè)備在PCR分子生物學(xué)技術(shù)中均是，只有在有序齊全的基礎(chǔ)上，才能進行PCR反應(yīng)并得出準(zhǔn)確結(jié)果。

PCR相關(guān)基礎(chǔ)實驗：

PCR反應(yīng)基本步驟一般的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)由20到35個循環(huán)組成，每個循環(huán)包括以下3個步驟：

一、變性：

利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個循環(huán)之前，通常加熱長一些時間以確保模板和引物分離，僅以單鏈形式存在。該步驟時間1-2分鐘，接下來PCR儀就控制溫度進入循環(huán)階段。

二、退火或稱接合,復(fù)性：

在DNA雙鏈分離后，降低溫度使得引物可以結(jié)合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點5℃。錯誤的退火溫度可能導(dǎo)致引物不與模板結(jié)合或者錯誤地結(jié)合。該步驟時間1-2分鐘。

三、延伸：

DNA聚合酶由降溫時結(jié)合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度。傳統(tǒng)的Taq估計合成1000bp/min、較新的Tbr（來自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒、商業(yè)公司生產(chǎn)的融合型聚合酶僅需約10-15秒。

PCR反應(yīng)條件優(yōu)化：

1、變性溫度和時間：

保證模板DNA解鏈?zhǔn)潜ＷC整個PCR擴增成功的關(guān)鍵。加熱90~95°C, 30~60s，再復(fù)雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過高或高溫持續(xù)時間過長，可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害。

2、復(fù)性溫度和時間:

PCR擴增特異性取決于復(fù)性過程中引物與模板的結(jié)合。復(fù)性溫度越高，產(chǎn)物特異性越高。復(fù)性溫度越低，產(chǎn)物特異性越低。需根據(jù)引物的Tm值具體設(shè)定。

3、延伸溫度和時間:

一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個核苷酸時，過高的延伸溫度不利于引物與模板的結(jié)合，可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應(yīng)時間，可根據(jù)待擴增片段的長度而定，小于1kb, 1min足夠；大于1kb需加長延伸時間。Taq酶可根據(jù)1kb/min增加時間。這里需要注意，延伸時間過長可能出現(xiàn)非特異擴增。因此需要設(shè)置恰到好處的延伸時間。

4、循環(huán)數(shù):

其他參數(shù)選定后，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20?25次循環(huán)后，PCR產(chǎn)物的積累即可達到最大值，實際操作中由于每步反應(yīng)的產(chǎn)率不可能達到100%，因此不管模板濃度是多少，20~30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)越多，非特異擴增增加。

公司正在出售的產(chǎn)品：