TRIzol LS Reagent

TRIzol LS Reagent公司正在出售的產(chǎn)品：非洲綠猴腎細(xì)胞系　羥磺基轉(zhuǎn)移2封閉多肽　頭孢霉屬通用PCR檢測(cè)試劑盒　大鼠肉毒堿脂酰轉(zhuǎn)移(CACT)ELISA試劑盒　錳過(guò)氧化物（MnP）活性比色法檢測(cè)試劑盒　南海沉積物赤桿菌　血清應(yīng)答因子結(jié)合蛋白1抗體

商品屬性：

是一種專(zhuān)門(mén)用于從液體樣本（如細(xì)菌、病毒、酵母、細(xì)胞、血液、組織懸液）中提取高質(zhì)量 RNA 的試劑。與 TRIzol Reagent 相比，區(qū)別在于其組分濃度，TRIzol LS Reagent 是一種用于提取液體樣本RNA 的濃縮試劑，故提取相同量樣本所需的用量相對(duì)較少。樣品在 TRIzol LS Reagent 中能夠充分被裂解，在樣品勻漿或裂解過(guò)程中，它可保持 RNA 的完整性，同時(shí)裂解細(xì)胞，溶解細(xì)胞內(nèi)含物，提取過(guò)程方便快速，整個(gè)操作在一小時(shí)內(nèi)便可以完成。應(yīng)用 TRIzol LS Reagent 獲得的總 RNA 蛋白質(zhì)和 DNA 污染極少，可用于 Northern Blot、反轉(zhuǎn)錄、ployA篩選、RNase 保護(hù)分析和基因克隆等后續(xù)分析。注意：(1)請(qǐng)勿應(yīng)用該試劑直接處理大塊固體組織，否則會(huì)影響 RNA 的產(chǎn)量。(2)該試劑含有強(qiáng)變性劑，請(qǐng)勿直接于皮膚接觸或吞咽，若接觸到皮膚或眼睛請(qǐng)盡快到醫(yī)院處理。實(shí)驗(yàn)時(shí)務(wù)必穿實(shí)驗(yàn)服，戴手套。
儲(chǔ)存：2-8℃避光保存，可保存 2 年。
自備試劑：氯仿，異丙醇，70％乙醇（DEPC 水配置），RnaseFree H2O。
實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：
RNA 制備的關(guān)鍵是要抑制細(xì)胞中的 RNA 分解酶和防止所用器具及試劑中的 RNA 分解酶的污染。因此，在實(shí)驗(yàn)中必須采取以下措施：戴一次性干凈手套；使用 RNA 操作專(zhuān)用實(shí)驗(yàn)臺(tái)；在操作過(guò)程中避免講話等等。通過(guò)以上辦法可以防止實(shí)驗(yàn)者的汗液、唾液中的 RNA 分解酶的污染。
注意事項(xiàng)：
1. 盡量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，應(yīng)在使用前用0.1%DEPC 水溶液在 37℃處理 12h，然后在 120℃高壓滅菌 30min 以除去殘留的 DEPC。
2. 用于 RNA 實(shí)驗(yàn)的試劑，須使用干熱滅菌（180℃，60min）或DEPC水處理相關(guān)容器，使用的無(wú)菌水須用0.1%的DEPC處理后再進(jìn)行高溫高壓滅菌。
3. RNA 實(shí)驗(yàn)用的試劑和無(wú)菌水都應(yīng)專(zhuān)用，避免混用后交叉污染。

PCR基本步驟及注意事項(xiàng)？

一、實(shí)驗(yàn)原理

PCR是體外人工選擇性擴(kuò)增DNA的一種方法，它類(lèi)似于生物體內(nèi)DNA的復(fù)制。在生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而體外PCR反應(yīng)同樣需要類(lèi)似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設(shè)計(jì)的特定序列，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定位置的擴(kuò)增；PCR Buffer提供一個(gè)反應(yīng)的緩沖環(huán)境；反應(yīng)過(guò)程同生物體內(nèi)一樣，DNA雙鏈打開(kāi)，引物結(jié)合模板，延伸形成新鏈。而這些過(guò)程在生物體內(nèi)靠DNA解旋酶解鏈，而在體外在通過(guò)控制反應(yīng)溫度實(shí)現(xiàn)的。如常用94℃變性模板DNA打開(kāi)雙鏈，在退火溫度處引物結(jié)合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反復(fù)重復(fù)此過(guò)程即可實(shí)現(xiàn)對(duì)特定片段DNA的大量擴(kuò)增。到第三循環(huán)開(kāi)始才產(chǎn)生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子，進(jìn)一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍。

在擴(kuò)增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來(lái)呈指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱(chēng)為平臺(tái)效應(yīng)。平臺(tái)期(Plateau)會(huì)使原先由于錯(cuò)配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增，達(dá)到較高水平。因此，應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺(tái)期前結(jié)束反應(yīng)， 減少非特異性產(chǎn)物。到達(dá)平臺(tái)期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式，主要包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產(chǎn)物，cDNA等，但不能為RNA。對(duì)于不同類(lèi)型的模板，其主要不同在于預(yù)變性的時(shí)間以及模板的量。一般對(duì)于大的基因組DNA預(yù)變性時(shí)間10min足夠，質(zhì)粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預(yù)變性2min、PCR產(chǎn)物預(yù)變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA，但仍可做PCR的模板，只不過(guò)在第一輪循環(huán)時(shí)只有一個(gè)引物結(jié)合，合成另一條鏈。從第二輪開(kāi)始，兩個(gè)引物均與特異位點(diǎn)結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進(jìn)行PCR擴(kuò)增，原因就在于實(shí)現(xiàn)PCR反應(yīng)的是DNA聚合酶，只能特意識(shí)別DNA鏈。

2.對(duì)于模版的量來(lái)說(shuō)，一般25ul體系DNA的質(zhì)量為50—100ng。對(duì)于基因組DNA由于其結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，提取的濃度也往往比較大，為防止?jié)舛冗^(guò)大對(duì)PCR造成影響，故需對(duì)提取的DNA進(jìn)行梯度稀釋。否則濃度過(guò)高則可能會(huì)引起非特異性擴(kuò)增。對(duì)于質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物由于其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，且提取濃度一般較低，則無(wú)需稀釋。

PCR實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該注意的問(wèn)題有哪些?

沒(méi)有ct值

檢測(cè)結(jié)果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問(wèn)題:

1、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過(guò)45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準(zhǔn));

2、PCR程序設(shè)置錯(cuò)誤,檢測(cè)熒光信號(hào)的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時(shí)采集,TaqMan法則一般在退火結(jié)束時(shí)或延伸時(shí)采集信號(hào),另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解?？赏ㄟ^(guò)PAGE電泳檢測(cè)引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過(guò)500ng,根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)即可), 對(duì)未知濃度的樣本應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應(yīng)考慮樣本準(zhǔn)備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲(chǔ)備,避免反復(fù)凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內(nèi)含子,以確保擴(kuò)增基因組DNA;上下游引物Tm值超過(guò)4℃以上也會(huì)影響擴(kuò)增)。

ct值過(guò)晚

在相對(duì)定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對(duì)定量中, 對(duì)低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會(huì)增大, 但是一般不宜超過(guò)40循環(huán), 否則定量不準(zhǔn)確。

因此,判斷Ct值出現(xiàn)過(guò)晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和目的進(jìn)行。

1、擴(kuò)增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進(jìn)行優(yōu)化;引物或探針設(shè)計(jì)不合理, 需要重新設(shè)計(jì);

2、PCR程序不合適, 改用三步法進(jìn)行反應(yīng), 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當(dāng)降低退火溫度; 退火/延伸時(shí)間短(可以在推薦的時(shí)間條件下延長(zhǎng)10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產(chǎn)物太長(zhǎng)。PCR產(chǎn)物設(shè)計(jì)超過(guò)500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進(jìn)行PCR檢測(cè)或?qū)⒛０暹M(jìn)行稀釋。

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