HotStart Bst 4.2 Basic Mix(可凍干)

HotStart Bst 4.2 Basic Mix(可凍干)公司正在出售的產(chǎn)品：鼻咽癌細(xì)胞　細(xì)胞色cP450 CYP26A1封閉多肽　牛免疫缺損病毒PCR檢測(cè)試劑盒　大鼠尿激型纖溶原激活物受體(PLAUR/uPAR)ELISA Kit　海藻糖6磷合成(TPS)活性比色法檢測(cè)試劑盒　成對(duì)桿菌　肌肉特定環(huán)指蛋白3抗體

公司產(chǎn)品僅供科研研究使用、不得用于臨床診斷！

描述：

2.5xBst4.2 Basic Mix 包含了 Helicaser、dNTP、Mg2+、反應(yīng)緩沖鹽、凍干賦形劑和穩(wěn)定劑。HotStart Bst4.2DNA/RNA 聚合酶為單獨(dú)的組分。本品不僅可作為常規(guī)檢測(cè)試劑，對(duì)于具有凍干經(jīng)驗(yàn)的研究者，
本品還直接進(jìn)行后續(xù)凍干，無(wú)需再加入任何其它輔料。

Bst4.2 具有以下性能：
（1）Bst 4.2 全系包含熱啟動(dòng)Aptamer，該配體確保酶在<30℃時(shí)，酶活封閉效率>95%,在>60℃時(shí) 1min 內(nèi)釋放酶活。該特性利于室溫建立反應(yīng)體系，并大幅降低了低溫條件下的非特異擴(kuò)增；
（2）反應(yīng)溫度提升到 70℃，大幅降低引物 Dimer 的形成，提高擴(kuò)增特異性，并使得粗樣品核酸釋放更加充分；
（3）全系包含 Helicaser，因此，允許在不使用 F3/B3 引物的情況下進(jìn)行 LAMP 擴(kuò)增（easy LAMP），并允許 FIP/BIP 的引物用量降低一倍。這將進(jìn)一步降低非特異擴(kuò)增，并使得擴(kuò)增均一性大幅提升。本品為多用途的試劑，適用于 LAMP 進(jìn)行 MolecularBeacon 探針、DP-LAMP 探針、試紙條等檢測(cè)。

儲(chǔ)存：長(zhǎng)期保存請(qǐng)置于-20℃以下（12 個(gè)月有效）；制品反復(fù)凍融10 次不影響性能，但應(yīng)避免反復(fù)凍融；制品由于含有高濃度的糖組分，-20℃保存的制品，在融化時(shí)可能會(huì)有結(jié)晶物。此時(shí) 2.5xBst4.2Mix 可在 37℃進(jìn)行融化，而 Bst4.2 酶制品在 30℃的溫度下融化，過(guò)高的溫度可能會(huì)導(dǎo)致熱啟動(dòng)性能下降。一經(jīng)融化推薦置于2-8℃保存，在此條件下制品穩(wěn)定儲(chǔ)存 6 個(gè)月。
特殊說(shuō)明：
（1） Bst4.2 DNA/RNA Polymerase 在用于 LAMP 擴(kuò)增時(shí)的推薦反應(yīng)溫度為 65-70℃，最佳反應(yīng)溫度為 70℃。因此其可替代 的 Bst4.0 系列，用于標(biāo)準(zhǔn) LAMP 的擴(kuò)增。
（2） 由于 Helicaser 的反應(yīng)溫度為 70℃，因此在進(jìn)行 eLAMP 擴(kuò)增時(shí)，反應(yīng)溫度為 70℃。
（3） 制品中包含高濃度的鹽組分，使用時(shí)做好個(gè)人防護(hù)，防止制品與皮膚、眼、鼻、呼吸道等接觸和吸入，一旦接觸或吸入，請(qǐng)用大量的清水沖洗。
（4）防止氣溶膠污染，盡可能進(jìn)行分區(qū)操作。
1. 標(biāo)準(zhǔn) LAMP 和 eLAMP 擴(kuò)增的區(qū)別本試劑既可以用于標(biāo)準(zhǔn) LAMP 擴(kuò)增，也可以用于 eLAMP擴(kuò)增。
1.1 10x 標(biāo)準(zhǔn) LAMP Primer MixFIP/BIP=16 μM each; LF/LB=4 μM each; F3/B3=2 μM each
1.2 10xeLAMP Primer MixFIP/BIP=8 μM each; LF/LB=4 μM each
注意：eLAMP（easy LAMP）為去除 F3/B3 引物的方法，為 Bst4.2系列專用的使用策略，對(duì)于大多數(shù)引物組，在 Helicaser 的加持下，擴(kuò)增速度幾乎不受影響。如引物擴(kuò)增效率低，可提高 FIP/BIP 濃度到 12~16uM。
1.3 擴(kuò)增溫度不同標(biāo)準(zhǔn) LAMP 擴(kuò)增 eLAMP 擴(kuò)增65-70°C 均可 70°C 反應(yīng)
2. 配制 LAMP 反應(yīng)體系
2.5xBst4.2 Basic Mix 10 μl
10x Primer Mix 2.5 μl
HotStart Bst 4.2（8U/μl） 1 μl
模板 DNA/RNA X μl
ddH2O 到總體積 25 μl
反應(yīng)體系配好后，置于 65-70°C 反應(yīng) 20~30min。
3. 試劑的凍干反應(yīng)（僅限專業(yè)人員）本試劑可供具有凍干經(jīng)驗(yàn)的人員直接進(jìn)行后續(xù)凍干，試劑的配方對(duì)凍干條件不苛刻。但對(duì)于不同的用戶來(lái)講，由于凍干形式、凍干體積、上機(jī)量、凍干容器、凍干磨具等因素存在差異，以下程序僅供參考。進(jìn)一步的程序優(yōu)化均需根據(jù)具體情況自行調(diào)整。對(duì)于非專業(yè)人員來(lái)講，請(qǐng)直接采購(gòu)  的凍干制品，或委托訂制。
2.5xBst4.2 Basic Mix 10 μl
25xPrimer Mix 1 μl
HotStart Bst 4.2（8U/μl） 1 μl
Total 12 μl
制品成型后的凍干程序：
-50℃預(yù)凍 10min； -50℃ 4-8h（真空段）；-50℃升溫到 25℃（每小時(shí)升溫 5℃）；25℃ 2h； 25℃恒溫。

PCR 反應(yīng)需要使用哪些試劑和設(shè)備？

試劑:
模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；引物：PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物，分別與模板DNA的兩端配對(duì)擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過(guò)程中使用到的引物；dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥(niǎo)苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成等生物學(xué)過(guò)程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；PCR buffer溶液：對(duì)PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測(cè)序等等實(shí)驗(yàn)步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來(lái)判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；
設(shè)備：
PCR儀：用于控制反應(yīng)溫度，保證PCR反應(yīng)時(shí)不同溫度環(huán)節(jié)的嚴(yán)格控制；電泳槽：用于分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；核酸提取儀：從組織樣本中全自動(dòng)提取核酸。  這些試劑和設(shè)備在PCR分子生物學(xué)技術(shù)中均是，只有在有序齊全的基礎(chǔ)上，才能進(jìn)行PCR反應(yīng)并得出準(zhǔn)確結(jié)果。

PCR相關(guān)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)：

PCR反應(yīng)基本步驟一般的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)由20到35個(gè)循環(huán)組成，每個(gè)循環(huán)包括以下3個(gè)步驟：

一、變性：

利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個(gè)循環(huán)之前，通常加熱長(zhǎng)一些時(shí)間以確保模板和引物分離，僅以單鏈形式存在。該步驟時(shí)間1-2分鐘，接下來(lái)PCR儀就控制溫度進(jìn)入循環(huán)階段。

二、退火或稱接合,復(fù)性：

在DNA雙鏈分離后，降低溫度使得引物可以結(jié)合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點(diǎn)5℃。錯(cuò)誤的退火溫度可能導(dǎo)致引物不與模板結(jié)合或者錯(cuò)誤地結(jié)合。該步驟時(shí)間1-2分鐘。

三、延伸：

DNA聚合酶由降溫時(shí)結(jié)合上的引物開(kāi)始沿著DNA鏈合成互補(bǔ)鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時(shí)間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長(zhǎng)度。傳統(tǒng)的Taq估計(jì)合成1000bp/min、較新的Tbr（來(lái)自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒、商業(yè)公司生產(chǎn)的融合型聚合酶僅需約10-15秒。

PCR反應(yīng)條件優(yōu)化：

1、變性溫度和時(shí)間：

保證模板DNA解鏈?zhǔn)潜ＷC整個(gè)PCR擴(kuò)增成功的關(guān)鍵。加熱90~95°C, 30~60s，再?gòu)?fù)雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過(guò)高或高溫持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可對(duì)Taq酶活性和dNTP分子造成損害。

2、復(fù)性溫度和時(shí)間:

PCR擴(kuò)增特異性取決于復(fù)性過(guò)程中引物與模板的結(jié)合。復(fù)性溫度越高，產(chǎn)物特異性越高。復(fù)性溫度越低，產(chǎn)物特異性越低。需根據(jù)引物的Tm值具體設(shè)定。

3、延伸溫度和時(shí)間:

一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個(gè)核苷酸時(shí)，過(guò)高的延伸溫度不利于引物與模板的結(jié)合，可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應(yīng)時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定，小于1kb, 1min足夠；大于1kb需加長(zhǎng)延伸時(shí)間。Taq酶可根據(jù)1kb/min增加時(shí)間。這里需要注意，延伸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能出現(xiàn)非特異擴(kuò)增。因此需要設(shè)置恰到好處的延伸時(shí)間。

4、循環(huán)數(shù):

其他參數(shù)選定后，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。理論上說(shuō)20?25次循環(huán)后，PCR產(chǎn)物的積累即可達(dá)到最大值，實(shí)際操作中由于每步反應(yīng)的產(chǎn)率不可能達(dá)到100%，因此不管模板濃度是多少，20~30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)越多，非特異擴(kuò)增增加。

公司正在出售的產(chǎn)品：