HotStart Bst4.2 大規(guī)格(125ml包裝酶)

HotStart Bst4.2 大規(guī)格(125ml包裝酶)公司正在出售的產(chǎn)品：宮頸癌細(xì)胞　磷化結(jié)蛋白封閉多肽　牛腺病毒通用PCR檢測(cè)試劑盒　大鼠內(nèi)皮抑(ES)試劑盒 ELISA　果糖1,6二磷醛縮（FBA)活性比色法檢測(cè)試劑盒　中國(guó)臺(tái)灣別樣海源菌　BCL7B蛋白抗體

商品屬性：

Bst4.2 DNA/RNA Polymerase 經(jīng)酶電子重構(gòu)架和進(jìn)化篩選（in silico Design & invitro Evolution），其為Bst4.0 的升級(jí)品，通用于 DNA 或 RNA 的 LAMP 或RT-LAMP 擴(kuò)增。
性能提升包括 ：

（1 ）Bst 4.2 全系包含 熱啟動(dòng)Aptamer，該配體確保酶在<30℃時(shí)，酶活封閉效率>95%,在>60℃時(shí) 1min 內(nèi)釋放酶活。該特性利于室溫建立反應(yīng)體系，并大幅降低了低溫條件下的非特異擴(kuò)增；

（2）反應(yīng)溫度提升到 70℃，大幅降低引物 Dimer 的形成，提高擴(kuò)增特異性，并使得粗樣品核酸釋放更加充分；

（3）全系包含 Helicaser，因此，允許在不使用 F3/B3 引物的情況下進(jìn)行 LAMP 擴(kuò)增（easy LAMP），并允許 FIP/BIP 的引物用量降低一倍。這將進(jìn)一步降低非特異擴(kuò)增，并使得擴(kuò)增均一性大幅提升。

注意： HotStart Bst 4.2 DNA/RNA Polymerase（8U/μl）不含有甘油，可用于凍干體系的建立。
儲(chǔ)存：長(zhǎng)期保存請(qǐng)置于-20℃以下（12 個(gè)月有效）；制品反復(fù)凍融 10 次不影響性能，但應(yīng)避免反復(fù)凍融；制品由于含有高濃度的糖組分，-20℃保存的酶制品，在融化時(shí)可能會(huì)有結(jié)晶物，此時(shí)在 30℃的溫度下融化，過(guò)高的溫度可能會(huì)導(dǎo)致熱啟動(dòng)性能下降。一經(jīng)融化推薦置于 2-8℃保存，在此條件下制品穩(wěn)定儲(chǔ)存 6 個(gè)月。
特殊說(shuō)明：
（1） Bst4.2 DNA/RNA Polymerase 在用于 LAMP 擴(kuò)增時(shí)的推薦反應(yīng)溫度為 65-70℃，最佳反應(yīng)溫度為 70℃。因此其可替代  的 Bst4.0 系列，用于標(biāo)準(zhǔn) LAMP的擴(kuò)增。
（2） 由于 反應(yīng)溫度為 70℃，因此在進(jìn)行eLAMP 擴(kuò)增時(shí)，反應(yīng)溫度為 70℃。
1. 標(biāo)準(zhǔn) LAMP 擴(kuò)增
1.1 10xLAMP Primer Mix：FIP/BIP=16 μM each; LF/LB=4
μM each; F3/B3=2 μM each
1.2 配制 LAMP 反應(yīng)體系
10xBst4.2 Buffer(Mg2+ free) 2.5 μl
100mM Mg2+
1.5 μl
dNTP Mixture（10 mM each） 3 μl
10xLAMP Primer Mix 2.5 μl
HotStart Bst 4.2（8U/μl） 1 μl
模板 DNA/RNA X μl
ddH2O 到總體積 25 μl
1.3 反應(yīng)體系配好后，置于 65-70°C 反應(yīng) 20~30min。
2. eLAMP 擴(kuò)增
2.1 10xeLAMP Primer Mix ： FIP/BIP=8 μM each;
LF/LB=4 μM each。
注意：eLAMP（easy LAMP）為去除 F3/B3 引物的方法，為 Bst4.2 系列專用的使用策略，對(duì)于大多數(shù)引物組，在Helicaser 的加持下，擴(kuò)增速度幾乎不受影響。如引物擴(kuò)增效率低，可提高 FIP/BIP 濃度到 12~16uM。
2.2 配制 eLAMP 反應(yīng)體系
10xBst4.2 Buffer(Mg2+ free) 2.5 μl
100mM Mg2+
1.5 μl
dNTP Mixture（10 mM each） 3 μl
10xeLAMP Primer Mix 2.5 μl
HotStart Bst 4.2（8U/μl） 1 μl
模板 DNA/RNA X μl
ddH2O 到總體積 25 μl
2.3 eLAMP 的擴(kuò)增溫度為 70°C，反應(yīng) 20~30min。
其它注意事項(xiàng)
(1) 制品中包含高濃度的鹽組分，使用時(shí)做好個(gè)人防護(hù)，防止制品與皮膚、眼、鼻、呼吸道等接觸和吸入，一旦接觸或吸入，請(qǐng)用大量的清水沖洗。
(2) 防止氣溶膠污染，盡可能進(jìn)行分區(qū)操作。

PCR基本步驟及注意事項(xiàng)？

一、實(shí)驗(yàn)原理

PCR是體外人工選擇性擴(kuò)增DNA的一種方法，它類(lèi)似于生物體內(nèi)DNA的復(fù)制。在生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而體外PCR反應(yīng)同樣需要類(lèi)似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設(shè)計(jì)的特定序列，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定位置的擴(kuò)增；PCR Buffer提供一個(gè)反應(yīng)的緩沖環(huán)境；反應(yīng)過(guò)程同生物體內(nèi)一樣，DNA雙鏈打開(kāi)，引物結(jié)合模板，延伸形成新鏈。而這些過(guò)程在生物體內(nèi)靠DNA解旋酶解鏈，而在體外在通過(guò)控制反應(yīng)溫度實(shí)現(xiàn)的。如常用94℃變性模板DNA打開(kāi)雙鏈，在退火溫度處引物結(jié)合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反復(fù)重復(fù)此過(guò)程即可實(shí)現(xiàn)對(duì)特定片段DNA的大量擴(kuò)增。到第三循環(huán)開(kāi)始才產(chǎn)生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子，進(jìn)一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍。

在擴(kuò)增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來(lái)呈指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺(tái)效應(yīng)。平臺(tái)期(Plateau)會(huì)使原先由于錯(cuò)配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增，達(dá)到較高水平。因此，應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺(tái)期前結(jié)束反應(yīng)， 減少非特異性產(chǎn)物。到達(dá)平臺(tái)期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式，主要包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產(chǎn)物，cDNA等，但不能為RNA。對(duì)于不同類(lèi)型的模板，其主要不同在于預(yù)變性的時(shí)間以及模板的量。一般對(duì)于大的基因組DNA預(yù)變性時(shí)間10min足夠，質(zhì)粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預(yù)變性2min、PCR產(chǎn)物預(yù)變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA，但仍可做PCR的模板，只不過(guò)在第一輪循環(huán)時(shí)只有一個(gè)引物結(jié)合，合成另一條鏈。從第二輪開(kāi)始，兩個(gè)引物均與特異位點(diǎn)結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進(jìn)行PCR擴(kuò)增，原因就在于實(shí)現(xiàn)PCR反應(yīng)的是DNA聚合酶，只能特意識(shí)別DNA鏈。

2.對(duì)于模版的量來(lái)說(shuō)，一般25ul體系DNA的質(zhì)量為50—100ng。對(duì)于基因組DNA由于其結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，提取的濃度也往往比較大，為防止?jié)舛冗^(guò)大對(duì)PCR造成影響，故需對(duì)提取的DNA進(jìn)行梯度稀釋。否則濃度過(guò)高則可能會(huì)引起非特異性擴(kuò)增。對(duì)于質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物由于其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，且提取濃度一般較低，則無(wú)需稀釋。

PCR實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該注意的問(wèn)題有哪些?

沒(méi)有ct值

檢測(cè)結(jié)果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問(wèn)題:

1、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過(guò)45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準(zhǔn));

2、PCR程序設(shè)置錯(cuò)誤,檢測(cè)熒光信號(hào)的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時(shí)采集,TaqMan法則一般在退火結(jié)束時(shí)或延伸時(shí)采集信號(hào),另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解?？赏ㄟ^(guò)PAGE電泳檢測(cè)引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過(guò)500ng,根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)即可), 對(duì)未知濃度的樣本應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應(yīng)考慮樣本準(zhǔn)備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲(chǔ)備,避免反復(fù)凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內(nèi)含子,以確保擴(kuò)增基因組DNA;上下游引物Tm值超過(guò)4℃以上也會(huì)影響擴(kuò)增)。

ct值過(guò)晚

在相對(duì)定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對(duì)定量中, 對(duì)低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會(huì)增大, 但是一般不宜超過(guò)40循環(huán), 否則定量不準(zhǔn)確。

因此,判斷Ct值出現(xiàn)過(guò)晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和目的進(jìn)行。

1、擴(kuò)增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進(jìn)行優(yōu)化;引物或探針設(shè)計(jì)不合理, 需要重新設(shè)計(jì);

2、PCR程序不合適, 改用三步法進(jìn)行反應(yīng), 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當(dāng)降低退火溫度; 退火/延伸時(shí)間短(可以在推薦的時(shí)間條件下延長(zhǎng)10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產(chǎn)物太長(zhǎng)。PCR產(chǎn)物設(shè)計(jì)超過(guò)500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進(jìn)行PCR檢測(cè)或?qū)⒛０暹M(jìn)行稀釋。

公司正在出售的產(chǎn)品：