Bst 4.0 Basic Bead

Bst 4.0 Basic Bead公司正在出售的產(chǎn)品：人胚惡性畸胎瘤細(xì)胞　腫瘤抑制基因p63α封閉多肽　牛腸杯狀病毒PCR檢測(cè)試劑盒　大鼠內(nèi)源性糖皮質(zhì)激(GC)ELISA試劑盒　過(guò)氧化氫（H2O2）活性比色法檢測(cè)試劑盒　遠(yuǎn)青弧菌　蛋白體PSMβ6抗體

商品屬性：

該制品為全體系凍干微球制品，內(nèi)含恒溫?cái)U(kuò)增所用的反應(yīng)緩沖液、Mg2+、dNTP、Bst 4.0 DNA/RNA 聚合酶等，其不包含任何染料，使用時(shí)只需要加入引物、模板即可進(jìn)行核酸恒溫?cái)U(kuò)增。Bst 4.0 DNA/RNA 聚合酶具有依賴(lài)于 RNA 模板的聚合酶活性（逆轉(zhuǎn)錄），還具有依賴(lài)于DNA 的聚合酶活性，因此無(wú)論 DNA 或 RNA 樣本均可使用該制品進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增。該制品是進(jìn)行 LAMP 及RT-LAMP 擴(kuò)增反應(yīng)的試劑。
本制品不包含任何顯色染料，可自行搭配相關(guān)染料或檢測(cè)手段進(jìn)行 LAMP 反應(yīng)，包括搭配 OG 染料管進(jìn)行橙綠變色、搭配標(biāo)記 Oligo 進(jìn)行試紙條檢測(cè)、搭配熒光染料進(jìn)行熒光檢測(cè)、搭配 Molecular Beacon 探針進(jìn)行熒光檢測(cè)等方法。
儲(chǔ)存：-20℃保存 2 年；室溫（25℃）保存>6 個(gè)月。
使用方法：（進(jìn)行 LAMP 橙綠變色擴(kuò)增）：
1. 關(guān)于 OG 橙綠變色管說(shuō)明：橙綠變色染料（OG Dye）以烘干的形式預(yù)加在8聯(lián)管蓋上。LAMP反應(yīng)完畢后，將 0.2ml EP 管顛倒溶解 OG 染料后。LAMP的反應(yīng)產(chǎn)物將與 OG 染料形成綠色肉眼可見(jiàn)變色反應(yīng)（陽(yáng)性），而未擴(kuò)增的 EP 管為深橙色（陰性）。本試劑管常溫長(zhǎng)期保存。
2. 配制變色 LAMP 反應(yīng)體系
在 OG 染料管（0.2ml EP）反應(yīng)管中加入下述試劑
Bst4.0 Basic Bead 1 粒
10xLAMP Primer Mix 2.5 μl
模板 DNA/RNA X μl
ddH2O 到總體積 25 μl
10xLAMP Primer Mix 濃度：FIP/BIP 分別為 16 μM、
注意：全部試劑加入完畢后，輕彈 EP 管底部后，再蓋上 OG 橙
3. 反應(yīng)體系配好后，置于 65°C 進(jìn)行反應(yīng) 15~30min。（擴(kuò)增良好的引物組合，通常 20min 即可變色，一般不超過(guò)30min）。
4. 觀察結(jié)果：反應(yīng)結(jié)束后，從加熱裝置中將反應(yīng)管取出，室溫 2min，使整個(gè)反應(yīng)管冷卻下來(lái)。再次用力將反應(yīng)管
注意：
（1）觀察結(jié)果時(shí)，盡可能不要與配制反應(yīng)空間共用，以防止污染操作臺(tái)。
（2）盡管  選取的為高密封
注意事項(xiàng)：
（1）關(guān)于礦物油的使用，在配制完 LAMP 反應(yīng)體系后，可加入一滴礦物油覆蓋于反應(yīng)液上部，以減少氣溶膠的污
（2）在使用其它熒光染料時(shí)，使用濃度可自行優(yōu)化，通染料可能導(dǎo)致擴(kuò)增失敗。
（3）本試劑不支持，濁度、pH 變色、HNB 變色反應(yīng)，請(qǐng)勿嘗試。
（4）關(guān)于 LAMP 成品試劑的建議， Bst 4.0 Basic Bead凍干球和 OG 橙綠變色管均為室溫穩(wěn)定狀態(tài)，可長(zhǎng)期保存。將擴(kuò)增引物加入到 OG 橙綠變色管底部，于 70°C 烘干，再加入一粒凍干球即可制備成全體系檢測(cè)試劑。

PCR基本步驟及注意事項(xiàng)？

一、實(shí)驗(yàn)原理

PCR是體外人工選擇性擴(kuò)增DNA的一種方法，它類(lèi)似于生物體內(nèi)DNA的復(fù)制。在生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而體外PCR反應(yīng)同樣需要類(lèi)似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設(shè)計(jì)的特定序列，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定位置的擴(kuò)增；PCR Buffer提供一個(gè)反應(yīng)的緩沖環(huán)境；反應(yīng)過(guò)程同生物體內(nèi)一樣，DNA雙鏈打開(kāi)，引物結(jié)合模板，延伸形成新鏈。而這些過(guò)程在生物體內(nèi)靠DNA解旋酶解鏈，而在體外在通過(guò)控制反應(yīng)溫度實(shí)現(xiàn)的。如常用94℃變性模板DNA打開(kāi)雙鏈，在退火溫度處引物結(jié)合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反復(fù)重復(fù)此過(guò)程即可實(shí)現(xiàn)對(duì)特定片段DNA的大量擴(kuò)增。到第三循環(huán)開(kāi)始才產(chǎn)生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子，進(jìn)一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍。

在擴(kuò)增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來(lái)呈指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)變成平坦的曲線(xiàn),產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱(chēng)為平臺(tái)效應(yīng)。平臺(tái)期(Plateau)會(huì)使原先由于錯(cuò)配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增，達(dá)到較高水平。因此，應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺(tái)期前結(jié)束反應(yīng)， 減少非特異性產(chǎn)物。到達(dá)平臺(tái)期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式，主要包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產(chǎn)物，cDNA等，但不能為RNA。對(duì)于不同類(lèi)型的模板，其主要不同在于預(yù)變性的時(shí)間以及模板的量。一般對(duì)于大的基因組DNA預(yù)變性時(shí)間10min足夠，質(zhì)粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預(yù)變性2min、PCR產(chǎn)物預(yù)變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA，但仍可做PCR的模板，只不過(guò)在第一輪循環(huán)時(shí)只有一個(gè)引物結(jié)合，合成另一條鏈。從第二輪開(kāi)始，兩個(gè)引物均與特異位點(diǎn)結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進(jìn)行PCR擴(kuò)增，原因就在于實(shí)現(xiàn)PCR反應(yīng)的是DNA聚合酶，只能特意識(shí)別DNA鏈。

2.對(duì)于模版的量來(lái)說(shuō)，一般25ul體系DNA的質(zhì)量為50—100ng。對(duì)于基因組DNA由于其結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，提取的濃度也往往比較大，為防止?jié)舛冗^(guò)大對(duì)PCR造成影響，故需對(duì)提取的DNA進(jìn)行梯度稀釋。否則濃度過(guò)高則可能會(huì)引起非特異性擴(kuò)增。對(duì)于質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物由于其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，且提取濃度一般較低，則無(wú)需稀釋。

PCR實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該注意的問(wèn)題有哪些?

沒(méi)有ct值

檢測(cè)結(jié)果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問(wèn)題:

1、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過(guò)45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準(zhǔn));

2、PCR程序設(shè)置錯(cuò)誤,檢測(cè)熒光信號(hào)的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時(shí)采集,TaqMan法則一般在退火結(jié)束時(shí)或延伸時(shí)采集信號(hào),另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解?？赏ㄟ^(guò)PAGE電泳檢測(cè)引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過(guò)500ng,根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)即可), 對(duì)未知濃度的樣本應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應(yīng)考慮樣本準(zhǔn)備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲(chǔ)備,避免反復(fù)凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內(nèi)含子,以確保擴(kuò)增基因組DNA;上下游引物Tm值超過(guò)4℃以上也會(huì)影響擴(kuò)增)。

ct值過(guò)晚

在相對(duì)定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對(duì)定量中, 對(duì)低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會(huì)增大, 但是一般不宜超過(guò)40循環(huán), 否則定量不準(zhǔn)確。

因此,判斷Ct值出現(xiàn)過(guò)晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和目的進(jìn)行。

1、擴(kuò)增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進(jìn)行優(yōu)化;引物或探針設(shè)計(jì)不合理, 需要重新設(shè)計(jì);

2、PCR程序不合適, 改用三步法進(jìn)行反應(yīng), 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當(dāng)降低退火溫度; 退火/延伸時(shí)間短(可以在推薦的時(shí)間條件下延長(zhǎng)10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產(chǎn)物太長(zhǎng)。PCR產(chǎn)物設(shè)計(jì)超過(guò)500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進(jìn)行PCR檢測(cè)或?qū)⒛０暹M(jìn)行稀釋。

公司正在出售的產(chǎn)品：