pBM28 Toposmart 克隆試劑盒

pBM28 Toposmart 克隆試劑盒公司正在出售的產(chǎn)品：人肝癌細(xì)胞Luciferase熒光穩(wěn)轉(zhuǎn)株　氨基末端激2封閉多肽　貝巴魯病毒PCR檢測試劑盒　大鼠磷脂A2(PL-A2)ELISA檢測試劑盒　輔ⅡNADP(H)含量活性比色法檢測試劑盒　太平洋火色桿菌　環(huán)指蛋白92抗體

商品屬性：

保存條件：-20℃保存。
產(chǎn)品介紹：
利用痘苗病毒的拓?fù)洚悩?gòu)酶I(Topoisomerase I)的切割再連接的特點(diǎn)將PCR產(chǎn)物定向克隆到線性化的pBM28載體中。適用于克隆由Pfu、sPfu、KOD、Xerox、Phusion和Q5 等高保真DNA聚合酶擴(kuò)增的平末端PCR產(chǎn)物。pBM28 載體類似于公司的pENTR/D-TOPO入門載體， 具有attL1 和attL2，為gateway系統(tǒng)中的入門載體。引物M13F(-21)和M13R可用于菌落PCR和測序鑒定。
產(chǎn)品特點(diǎn)：
（1）連接反應(yīng)僅需 5 分鐘。
（2）只適合平末端 PCR 產(chǎn)物的快速、高效、定向克隆。
（3）載體采用了新的制備工藝，零背景，無需藍(lán)白斑篩選。
（4）與pBM27載體相比，pBM28載體無標(biāo)簽序列。
（5）載體為壯觀霉su抗性。
注意事項(xiàng)：
（1）引物要求：PCR 引物5’端不能進(jìn)行磷酸化修飾，普通商業(yè)化引物即可。上游引物的5’ 端添加CACC 四個堿基（CACC 為真核表達(dá)所必需的Kozak 序列）。
（2）DNA 聚合酶：選用Pfu、sPfu、Phusion、Q5、KOD 和Xerox 等高保真DNA 聚合酶用于PCR 擴(kuò)增。
（3）連接時間：5-15 分鐘，一般為 15 分鐘。
（4）連接溫度：室溫 (22℃-37℃)，可使用PCR儀控溫。最佳反應(yīng)溫度為25℃。若片段有高GC等復(fù)雜結(jié)構(gòu)，可在37℃反應(yīng)。
（5）產(chǎn)物要求：為保證PCR產(chǎn)物完整，建議72℃后延伸5-10分鐘。連接前使用瓊脂糖凝

PCR基本步驟及注意事項(xiàng)？

一、實(shí)驗(yàn)原理

PCR是體外人工選擇性擴(kuò)增DNA的一種方法，它類似于生物體內(nèi)DNA的復(fù)制。在生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而體外PCR反應(yīng)同樣需要類似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設(shè)計(jì)的特定序列，實(shí)現(xiàn)對特定位置的擴(kuò)增；PCR Buffer提供一個反應(yīng)的緩沖環(huán)境；反應(yīng)過程同生物體內(nèi)一樣，DNA雙鏈打開，引物結(jié)合模板，延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內(nèi)靠DNA解旋酶解鏈，而在體外在通過控制反應(yīng)溫度實(shí)現(xiàn)的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈，在退火溫度處引物結(jié)合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反復(fù)重復(fù)此過程即可實(shí)現(xiàn)對特定片段DNA的大量擴(kuò)增。到第三循環(huán)開始才產(chǎn)生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子，進(jìn)一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍。

在擴(kuò)增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來呈指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺效應(yīng)。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增，達(dá)到較高水平。因此，應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺期前結(jié)束反應(yīng)， 減少非特異性產(chǎn)物。到達(dá)平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式，主要包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產(chǎn)物，cDNA等，但不能為RNA。對于不同類型的模板，其主要不同在于預(yù)變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預(yù)變性時間10min足夠，質(zhì)粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預(yù)變性2min、PCR產(chǎn)物預(yù)變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA，但仍可做PCR的模板，只不過在第一輪循環(huán)時只有一個引物結(jié)合，合成另一條鏈。從第二輪開始，兩個引物均與特異位點(diǎn)結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進(jìn)行PCR擴(kuò)增，原因就在于實(shí)現(xiàn)PCR反應(yīng)的是DNA聚合酶，只能特意識別DNA鏈。

2.對于模版的量來說，一般25ul體系DNA的質(zhì)量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，提取的濃度也往往比較大，為防止?jié)舛冗^大對PCR造成影響，故需對提取的DNA進(jìn)行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴(kuò)增。對于質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物由于其結(jié)構(gòu)簡單，且提取濃度一般較低，則無需稀釋。

PCR實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該注意的問題有哪些?

沒有ct值

檢測結(jié)果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準(zhǔn));

2、PCR程序設(shè)置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結(jié)束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解?？赏ㄟ^PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據(jù)試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應(yīng)考慮樣本準(zhǔn)備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復(fù)凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內(nèi)含子,以確保擴(kuò)增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴(kuò)增)。

ct值過晚

在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準(zhǔn)確。

因此,判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和目的進(jìn)行。

1、擴(kuò)增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進(jìn)行優(yōu)化;引物或探針設(shè)計(jì)不合理, 需要重新設(shè)計(jì);

2、PCR程序不合適, 改用三步法進(jìn)行反應(yīng), 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當(dāng)降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產(chǎn)物太長。PCR產(chǎn)物設(shè)計(jì)超過500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進(jìn)行PCR檢測或?qū)⒛０暹M(jìn)行稀釋。

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