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詳細(xì)介紹
公司產(chǎn)品僅供科研研究使用、不得用于臨床診斷！
貨號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 |
A-Hc2191 | DNA Marker Ⅰ(for PAGE) 分子量標(biāo)準(zhǔn) | 200次（250ul×4支） |
A-Hc2191 | DNA Marker Ⅰ(for PAGE) 分子量標(biāo)準(zhǔn) | 2500次（250ul×50支） |
濃 度：50ng/5μl
保存條件：融化后于4℃保存，-20℃保存。
產(chǎn)品說明：
本公司生產(chǎn)的DNA Marker均通過酶切質(zhì)粒得到，該工藝生產(chǎn)的Marker背景干凈、條帶清晰，質(zhì)量穩(wěn)定且能實現(xiàn)對Marker精確定量。產(chǎn)品含有兩種染料（二甲苯青加溴酚藍(lán)）。
本產(chǎn)品為即用型產(chǎn)品，已含有1xLoading Buffer，可根據(jù)實驗需要，直接取適量Marker進行電泳。
DNA Marker Ⅰ由7條DNA條帶組成，DNA條帶分別為：100bp、 200bp 、300bp、 400bp 、500bp 、600bp 、700bp。
銀染方法：
一般加5μl跑電泳，根據(jù)膠孔大小可適當(dāng)增加或減少上樣量。
1.6% PAGE電泳。
2.卸膠到一個干凈的平皿中。
3.用水沖三次，倒掉。
4.加入0.1%硝銀染色，在脫色搖床上搖10-15分鐘。
5.倒掉硝銀溶液，用水洗3次。
6.加入新鮮配制的顯色劑（1.2%氫氧化鈉，0.4%甲醛）。
7.待條帶出現(xiàn)，立刻倒掉顯色劑，大量水沖洗，終止反應(yīng)。
8.盡快拍照記錄結(jié)果。
注意:
1.盡量用純度高水。
2.不要用手接觸膠，應(yīng)帶PE手套。
PCR 反應(yīng)需要使用哪些試劑和設(shè)備？
試劑:
模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；引物：PCR反應(yīng)的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成等生物學(xué)過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；PCR buffer溶液：對PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；
設(shè)備：
PCR儀：用于控制反應(yīng)溫度，保證PCR反應(yīng)時不同溫度環(huán)節(jié)的嚴(yán)格控制；電泳槽：用于分離PCR擴增產(chǎn)物；核酸提取儀：從組織樣本中全自動提取核酸。 這些試劑和設(shè)備在PCR分子生物學(xué)技術(shù)中均是，只有在有序齊全的基礎(chǔ)上，才能進行PCR反應(yīng)并得出準(zhǔn)確結(jié)果。
PCR相關(guān)基礎(chǔ)實驗：
PCR反應(yīng)基本步驟一般的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)由20到35個循環(huán)組成，每個循環(huán)包括以下3個步驟：
一、變性：
利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個循環(huán)之前，通常加熱長一些時間以確保模板和引物分離，僅以單鏈形式存在。該步驟時間1-2分鐘，接下來PCR儀就控制溫度進入循環(huán)階段。
二、退火或稱接合,復(fù)性：
在DNA雙鏈分離后，降低溫度使得引物可以結(jié)合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點5℃。錯誤的退火溫度可能導(dǎo)致引物不與模板結(jié)合或者錯誤地結(jié)合。該步驟時間1-2分鐘。
三、延伸：
DNA聚合酶由降溫時結(jié)合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度。傳統(tǒng)的Taq估計合成1000bp/min、較新的Tbr（來自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒、商業(yè)公司生產(chǎn)的融合型聚合酶僅需約10-15秒。
PCR反應(yīng)條件優(yōu)化：
1、變性溫度和時間：
保證模板DNA解鏈?zhǔn)潜ＷC整個PCR擴增成功的關(guān)鍵。加熱90~95°C, 30~60s，再復(fù)雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過高或高溫持續(xù)時間過長，可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害。
2、復(fù)性溫度和時間:
PCR擴增特異性取決于復(fù)性過程中引物與模板的結(jié)合。復(fù)性溫度越高，產(chǎn)物特異性越高。復(fù)性溫度越低，產(chǎn)物特異性越低。需根據(jù)引物的Tm值具體設(shè)定。
3、延伸溫度和時間:
一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個核苷酸時，過高的延伸溫度不利于引物與模板的結(jié)合，可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應(yīng)時間，可根據(jù)待擴增片段的長度而定，小于1kb, 1min足夠；大于1kb需加長延伸時間。Taq酶可根據(jù)1kb/min增加時間。這里需要注意，延伸時間過長可能出現(xiàn)非特異擴增。因此需要設(shè)置恰到好處的延伸時間。
4、循環(huán)數(shù):
其他參數(shù)選定后，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20?25次循環(huán)后，PCR產(chǎn)物的積累即可達(dá)到最大值，實際操作中由于每步反應(yīng)的產(chǎn)率不可能達(dá)到100%，因此不管模板濃度是多少，20~30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)越多，非特異擴增增加。
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