單體親和素磁珠

商品屬性：

親和素（或鏈霉親和素）和生物su之間表現(xiàn)的相互作用，是已知的非共價相互作用最高的一種。親和素、鏈霉親和素、 單體親和素及其類似物已成為探針研究實驗中強大的親和配體工具，被廣泛應(yīng)用于生化分析、診斷、親和純化和藥物遞送。Monomer Avidin Magnetic Beads是一種高度均勻的超順磁性微球，表面包裹著高密度的超純（>97%）亞單位單體親和素。單體親和素源自天然四聚體蛋白，它保留了與天然親和素相同的生物su結(jié)合特異性，但其生物su結(jié)合親和力會有顯著降低（kD=~10-8 M）。因此，通過使用溫和的洗脫條件，例如含有2 mM 生物su的緩沖液，就可以很容易地從單體親和素中洗脫結(jié)合的生物su化分子。本款磁珠經(jīng)過專門設(shè)計、測試和質(zhì)量控制，可用于免疫沉淀、細胞分選，以及從細胞裂 解液或雜交反應(yīng)中快速一步捕獲生物su化分子，如DNA、RNA、抗體或蛋白質(zhì)。

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產(chǎn)品特點：

·快捷，簡單的一步法高通量操作;無需純化柱或過濾器，或重復(fù)移液、離心等操作

（圖1）

·結(jié)合能力，在溫和的條件下洗脫結(jié)合的生物su化分子

·在溫和的洗脫條件下純化生物su化樣品

·極小的非特異性結(jié)合

·對樣本體積要求低，便于自動化操作

·成本低：只有市場同類產(chǎn)品磁珠價格的一半

·磁珠至少可以重復(fù)使用5次

緩沖液

·1x PBS Buffer (0.1 M 磷酸鈉, 0.15 M 氯化鈉; pH 7 ) ·1x Regeneration Buffer (0.1 M Glycine/HCl,pH 2.8) ·1x Blocking/Elution Buffer (2 mM D-生物su溶于 PBS)

磁力分離器（適用于手動操作）：根據(jù)實驗時生物樣品的體積，使用者可以選擇以下不同型號的磁力分離器： 8 孔磁力架可以容納 8 個單獨的 1.5-2.0 ml 離心管 ; 24

孔磁力架可以容納 24 個單獨的 1.5-2.0 ml 離心管; 4 孔磁力-15 可以容納 4 個單獨的15ml 離心管; 4 孔磁力架-50 可以容納四個單獨的 50 ml 離心管。

操作過程

操作過程中實驗體積可根據(jù)需要放大或者縮小

提示：在純化生物su化蛋白質(zhì)、多肽和其他分子之前。用戶應(yīng)將試劑盒中的所有試劑溫度 平衡至室溫，并用雙蒸餾水配制 1x 工作溶液。

1. 輕輕震動裝有磁珠的試劑瓶，直到磁珠懸浮。將 50µl 磁珠轉(zhuǎn)移到新試管中。

提示：客戶應(yīng)根據(jù)每個實驗粗樣品中生物su化分子的數(shù)量，根據(jù)經(jīng)驗確定最佳的磁珠

使用量。過多的磁珠會導(dǎo)致背景更高；磁珠使用量少會造成產(chǎn)量降低。我們建議純化50μg 生物su化分子添加 50μl 懸浮的磁珠。

2. 將試管放在磁力分離器上1 分鐘。當磁珠沉淀時，去除上清液。取下試管加入四倍 磁珠體積的d2H2O，充分混合。并將試管再次置于磁力分離器上1 分鐘，去除上清 液。

3. 按照步驟2 所述方式，用四倍磁珠體積的1x PBS 緩沖液清洗磁珠。

4. 加入三倍磁珠體積的1xBlocking / Elution Buffer，通過渦旋充分混合，并在室溫下培養(yǎng)5 分鐘。將試管放在磁力分離器上1 分鐘。去除上清液。

5. 加入六倍磁珠體積的1xRegenerationBuffer，通過渦漩充分混合，并將試管放在磁力分離 器上1 分鐘。去除上清液。

6. 加入四倍磁珠體積的1x PBS Buffer，并按照步驟2 所述方式清洗磁珠。這些磁珠可以隨時使用。

提示：必須立即使用磁珠，否則粘合能力將顯著降低。

7. 向磁珠中加入含有生物su化分子的樣品，通過移液器吹吸充分混合，并在室溫下緩慢旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)30-60 分鐘。

8. 將試管放在磁力分離器上，保持試管留在分離器上的同時去除上清液。如步驟 2 所示， 用1x PBS 清洗磁珠，直到在280 nm 處洗脫液的吸光度接近背景水平（OD280<0.05）。

9. 加入一倍磁珠體積的Blocking/Elution Buffer，通過移液器吹吸充分混合，并在室溫下培養(yǎng) 5-10 分鐘，將與磁珠結(jié)合的生物su化分子洗脫下來。

PCR基本步驟及注意事項？

一、實驗原理

PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法，它類似于生物體內(nèi)DNA的復(fù)制。在生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而體外PCR反應(yīng)同樣需要類似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設(shè)計的特定序列，實現(xiàn)對特定位置的擴增；PCR Buffer提供一個反應(yīng)的緩沖環(huán)境；反應(yīng)過程同生物體內(nèi)一樣，DNA雙鏈打開，引物結(jié)合模板，延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內(nèi)靠DNA解旋酶解鏈，而在體外在通過控制反應(yīng)溫度實現(xiàn)的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈，在退火溫度處引物結(jié)合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反復(fù)重復(fù)此過程即可實現(xiàn)對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環(huán)開始才產(chǎn)生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子，進一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍。

在擴增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來呈指數(shù)擴增的反應(yīng)變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺效應(yīng)。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴增，達到較高水平。因此，應(yīng)適當調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺期前結(jié)束反應(yīng)， 減少非特異性產(chǎn)物。到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式，主要包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產(chǎn)物，cDNA等，但不能為RNA。對于不同類型的模板，其主要不同在于預(yù)變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預(yù)變性時間10min足夠，質(zhì)粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預(yù)變性2min、PCR產(chǎn)物預(yù)變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA，但仍可做PCR的模板，只不過在第一輪循環(huán)時只有一個引物結(jié)合，合成另一條鏈。從第二輪開始，兩個引物均與特異位點結(jié)合，從而實現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增，原因就在于實現(xiàn)PCR反應(yīng)的是DNA聚合酶，只能特意識別DNA鏈。

2.對于模版的量來說，一般25ul體系DNA的質(zhì)量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，提取的濃度也往往比較大，為防止?jié)舛冗^大對PCR造成影響，故需對提取的DNA進行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增。對于質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物由于其結(jié)構(gòu)簡單，且提取濃度一般較低，則無需稀釋。

PCR實驗中應(yīng)該注意的問題有哪些?

沒有ct值

檢測結(jié)果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準);

2、PCR程序設(shè)置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結(jié)束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解?？赏ㄟ^PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據(jù)試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應(yīng)考慮樣本準備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復(fù)凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內(nèi)含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

ct值過晚

在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準確。

因此,判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實驗設(shè)計和目的進行。

1、擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優(yōu)化;引物或探針設(shè)計不合理, 需要重新設(shè)計;

2、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應(yīng), 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產(chǎn)物太長。PCR產(chǎn)物設(shè)計超過500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進行PCR檢測或?qū)⒛０暹M行稀釋。

公司正在出售的產(chǎn)品：