RNAfixer 無液氮 RNA 樣品儲存液

RNAfixer 無液氮 RNA 樣品儲存液公司正在出售的產(chǎn)品：鴨胚肝間質(zhì)細胞（永生化）　G蛋白偶聯(lián)嘌呤受體p2y12封閉多肽　滅鮭氣單胞菌PCR檢測試劑盒　大鼠膠原酶I(Collagenase I)ELISA檢測試劑盒　6磷酸葡萄糖酸脫氫酶（6PGDH）酶活性比色法檢測試劑盒　?，F(xiàn)青霉　卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白25抗體

商品屬性：

保存條件：

室溫(18-25℃)保存1 年以上，如果使用時發(fā)現(xiàn)有沉淀或者析出，可以37℃水浴加熱重新溶解后使用，重新溶解后不會影響產(chǎn)品質(zhì)量。
產(chǎn)品介紹：
RNAfixer 是一種液態(tài)的無毒的組織保存液體，可以迅速滲入新鮮組織細胞的胞漿中，在非凍狀態(tài)下原位穩(wěn)定和保護細胞內(nèi)的RNA。取下組織薄片后立刻浸入RNAfixer 保存并不影響將來提取RNA 的質(zhì)量和數(shù)量。RNAfixer 消除了RNA 樣品需要立刻處理或者必須液氮保存的不方便。浸入RNAfixer 后，新鮮組織細胞中RNA 可以完好的在37℃下保存一天，在25℃下保存一周，4℃下保存一個月，在-20℃或-80℃下長期保存。
RNA 病毒樣品(如HCV 和HIV)可在37℃保存一個月。適用于動物組織（心、肝、腎、肌肉、睪丸、腦、脾等）、培養(yǎng)細胞、RNA 病毒、 果蠅、細菌、白細胞、一些植物組織等。
產(chǎn)品特點：
1.操作容易：將組織成適當大小，浸沒在RNAfixer 中即可使其RNA 不被降解。
2.無需液氮：使樣品的保存不需液氮,干冰或-80℃冰箱,尤其適用于臨床和野外樣品的快速和大規(guī)模采集。
3.方便運輸：處理過的樣品能在25℃保存一周,使樣品郵寄和運輸變得容易和便宜,有利學術(shù)合作和交流。
4.多次凍融: 經(jīng)RNAfixer 處理的樣品可反復凍融多次, 其間可對樣品進行各種處理而不影響最終提取的RNA 的質(zhì)量。
5.可比性強: RNAfixer 能減少大規(guī)模樣品處理中的誤差,增加各次實驗數(shù)間的可比性, 對大規(guī)?；虮磉_譜的分析尤其有用。
使用說明：
RNAfixer 只用于新鮮組織，浸泡入 RNAfixer 前禁止冷凍組織。只需要迅速將新鮮組織成長、寬，高任意一邊厚度<0.5 厘米浸泡入 RNAfixer 即可（只要有一邊厚度不超過 0.5 厘米，RNAfixer 可以迅速滲透，其它兩邊的尺寸并不重要）。將新鮮組織浸泡 在 5 倍體積的 RNAfixer 中，按照指示存放在適當?shù)臏囟取?/span>
1.動物組織 RNAfixer 并不破壞或者溶解組織結(jié)構(gòu)，因此浸泡在 RNAfixer 中達到滲透平衡的組織 可以從 RNAfixer 中取出，然后切成更小的塊，然后放回到 RNAfixer 中下次繼續(xù)使用。小器官如小鼠肝、腎、脾不需要剪切,可以完整的存放在 RNAfixer 中。
推薦不同組織樣品的 RNAstore 使用量：

 2.植物組織很多植物組織直接浸泡入 RNAfixer 即可，有的植物有天然滲透屏障如臘質(zhì)保護層，需要先破壞掉臘質(zhì)層,便于 RNAfixer 滲透。
3.組織培養(yǎng)細胞細胞吹打下來后,離心收集細胞,棄上清，用冰浴的 PBS 緩沖液洗一次去除殘留培養(yǎng)液。將細胞懸浮在少量 PBS 緩沖液中。加入五到十倍體積 RNAfixer, 混均。
4.白細胞對于全血中白細胞的保存，需將白細胞從紅細胞和血清中分離出來，并按組織培養(yǎng)細胞一樣處理后，白細胞便能有效地保存在 RNAfixer 中。不要將全血、血漿或血清中的 RNA 保存在 RNAfixer 中，因為它們蛋白含量過高，與 RNAfixer 混合后易形成不溶的沉淀。
5.細菌
細菌并不能在 RNAfixer 中生長，但是 RNAfixer 并不破壞細菌，E. coli 在 4℃保存一個月仍舊可以提出完整的 RNA。
RNAfixer 中樣本的存放：
1.存放在-80℃樣品長期保存用。將 RNA fixer 中樣本放置于 4℃過夜，然后將樣本撈出，盡量去除干凈 RNAfixer 液體，然后放置于-80℃。對于組織培養(yǎng)細胞，則不需要去除RNAfixer，直接冷凍于-80℃，并不會裂解細胞。樣品使用時可以在室溫融化，并且還可以再次冷凍而不影響 RNA 的完整性和產(chǎn)量。
2.存放在-20℃將 RNAfixer 中樣本放置于 4℃過夜，然后轉(zhuǎn)移到-20℃。在-20℃樣品并不會被冰凍,但是可能會形成一些結(jié)晶，這并不會影響將來的 RNA 提取。樣品使用時可以在室溫 融化，并且還可以再次冷凍而不影響 RNA 的完整性和產(chǎn)量。
3.存放在 4℃樣本可以在 4℃存放一個月。
4.存放于 25℃存放于 25℃樣本的 RNA 在一周內(nèi)保持完整，保存兩周的樣品 RNA 有輕微降解，勉強能用于northern analysis, 但是質(zhì)量足夠用于nuclease protection assay or RT-PCR 。
5.存放于 37℃存放于 37℃樣本的 RNA 在 24 小時內(nèi)保持完整，3 天的時候有部分降解。RNAfixer 保存樣本的 RNA 提?。?/span>將樣本從 RNAfixer 中取出,RNAfixer 可以直接倒入水池，用自來水沖即可，不需特殊處理。
1.組織
用干凈鑷子將樣本從 RNAfixer 中撈出，用吸水紙稍稍吸去殘留的 RNAfixer 后，可以和新鮮組織一樣按照液氮研磨，然后勻漿處理的標準程序進行提取 RNA。
2.細胞
對于儲存在 RNAfixer 中的細胞有兩種選擇。一是去除 RNAfixer 后提取 RNA, 另一個是直接從細胞和 RNAfixer 的混合物提取。
1）去除 RNAfixer 后提取 RNA存放于 RNAfixer 中的細胞變得不那么脆弱，可以承受較高的離心速度而不被裂解。 我們有在 5000g 離心成功收集細胞的經(jīng)驗，由于每種細胞的強度不一樣，可以先用不重要的細胞做個預(yù)試驗，以保證在使用的速度下離心不會破壞細胞。另一個選擇是在離心前加等體積的 PBS 稀釋 RNAfixer 和細胞的混合物，以減少溶液的密度，使細胞溶液可以沉淀下來。
2）不去除 RNAfixer，直接提取 RNA
也可以直接加 10 倍體積的一步法提取試劑（如 TRIpure，TRI reagent）到細胞和RNAfixer 的混合物，然后按照正常步驟操作。

PCR基本步驟及注意事項？

一、實驗原理

PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法，它類似于生物體內(nèi)DNA的復制。在生物體內(nèi)DNA復制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而體外PCR反應(yīng)同樣需要類似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設(shè)計的特定序列，實現(xiàn)對特定位置的擴增；PCR Buffer提供一個反應(yīng)的緩沖環(huán)境；反應(yīng)過程同生物體內(nèi)一樣，DNA雙鏈打開，引物結(jié)合模板，延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內(nèi)靠DNA解旋酶解鏈，而在體外在通過控制反應(yīng)溫度實現(xiàn)的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈，在退火溫度處引物結(jié)合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反復重復此過程即可實現(xiàn)對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環(huán)開始才產(chǎn)生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子，進一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍。

在擴增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來呈指數(shù)擴增的反應(yīng)變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺效應(yīng)。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴增，達到較高水平。因此，應(yīng)適當調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺期前結(jié)束反應(yīng)， 減少非特異性產(chǎn)物。到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式，主要包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產(chǎn)物，cDNA等，但不能為RNA。對于不同類型的模板，其主要不同在于預(yù)變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預(yù)變性時間10min足夠，質(zhì)粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預(yù)變性2min、PCR產(chǎn)物預(yù)變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA，但仍可做PCR的模板，只不過在第一輪循環(huán)時只有一個引物結(jié)合，合成另一條鏈。從第二輪開始，兩個引物均與特異位點結(jié)合，從而實現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增，原因就在于實現(xiàn)PCR反應(yīng)的是DNA聚合酶，只能特意識別DNA鏈。

2.對于模版的量來說，一般25ul體系DNA的質(zhì)量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結(jié)構(gòu)比較復雜，提取的濃度也往往比較大，為防止?jié)舛冗^大對PCR造成影響，故需對提取的DNA進行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增。對于質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物由于其結(jié)構(gòu)簡單，且提取濃度一般較低，則無需稀釋。

公司正在出售的產(chǎn)品：

PCR實驗中應(yīng)該注意的問題有哪些?

沒有ct值

檢測結(jié)果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準);

2、PCR程序設(shè)置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結(jié)束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解?？赏ㄟ^PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據(jù)試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應(yīng)考慮樣本準備中雜質(zhì)的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內(nèi)含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

ct值過晚

在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準確。

因此,判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實驗設(shè)計和目的進行。

1、擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優(yōu)化;引物或探針設(shè)計不合理, 需要重新設(shè)計;

2、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應(yīng), 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產(chǎn)物太長。PCR產(chǎn)物設(shè)計超過500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進行PCR檢測或?qū)⒛０暹M行稀釋。