從事多年的研發(fā)實驗，平時常常聽到客戶這樣問，為什么我也是用的這個感受態(tài)細胞，但轉(zhuǎn)化效率沒那么高？今天上海淳麥生物科研者為大家進行詳細講解，教你如何提高感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化率。

感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率定義

轉(zhuǎn)化效率定義為轉(zhuǎn)化1μl質(zhì)粒至給定體積的感受態(tài)細胞中所能產(chǎn)生的菌落形成單位（cfu）的數(shù)量。但是，轉(zhuǎn)化1μl質(zhì)粒是不常見的。

實際上，轉(zhuǎn)化效率常以在適條件下轉(zhuǎn)化100pg—1ng高純度超螺旋質(zhì)粒來計算。

計算轉(zhuǎn)化效率（TE）的公式為：

TE=菌落數(shù)/μg/稀釋度。

轉(zhuǎn)化效率計算可以用來做比較細胞或連接效率。下面列出了推薦轉(zhuǎn)化方法和一些技巧以幫助獲得實驗結(jié)果。

推薦方案

一、轉(zhuǎn)化方法

1. 冰上解凍細胞

2. 細胞中加入10ng—100ng的質(zhì)粒DNA（1-5μl），混勻，切忌渦旋

3. 置于冰上30分鐘

4. 42熱激60秒或根據(jù)推薦條件進行熱激

5. 置于冰上5分鐘

6. 加入900μl室溫的SOC

7. 37震蕩（250rpm）培養(yǎng)60分鐘

8. 混勻細胞，切忌渦旋，并用SOC做10倍梯度稀釋

9. 每個稀釋比例取50-100μl稀釋液涂布于預(yù)熱的選擇平板上，37（SHuffle菌株30）過夜培養(yǎng)或按推薦條件培養(yǎng)

    

二、5分鐘轉(zhuǎn)化方法

（與上述方法相比只有10%的轉(zhuǎn)化效率）

1. 手握解凍細胞

2. 細胞加入10ng—100ng的質(zhì)粒DNA（1-5μl），混勻，切忌渦旋

3. 置于冰上2分鐘

4. 42熱激30秒或按推薦方案進行熱激

5. 置于冰上2分鐘

6. 加入900μl室溫的SOC或LB?？焖偃?0-100μl涂布于選擇平板上，37過夜培養(yǎng)（SHuffle菌株30）

   注意：使用非氨芐青霉素時，需要37震蕩培養(yǎng)

    

轉(zhuǎn)化技巧

01、解凍

• 細胞在冰上解凍

• 管中的后一點感受態(tài)融化后，立即加入DNA

• 可以手握解凍細胞，但是一旦溫度高于0時，轉(zhuǎn)化效率就會下降

• 細胞與DNA冰浴

• 冰浴30分鐘。預(yù)計每縮短10分鐘會降低轉(zhuǎn)化效率2倍

   

02、熱激

• 溫度和時間取決于轉(zhuǎn)化體積和適用的容器，一般為42孵育60秒

   

03、生長

• 37生長1小時對于細胞恢復(fù)和抗生素抗藥性表達具有效果。預(yù)計每縮短15分鐘會有2倍的轉(zhuǎn)化效率損失

• SOC比LB培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)化效率高2倍

• 震蕩或旋轉(zhuǎn)晃動試管可使轉(zhuǎn)化效率提高2倍

   

04、涂平板

• 選擇轉(zhuǎn)化效率不受溫度、濕度明顯影響的平板

• 溫暖而干燥的平板利于涂布，并能快速長出菌落

   

05、DNA

• 用于轉(zhuǎn)化的DNA應(yīng)純化，并重懸于水中或TE緩沖液中

• 直接從連接產(chǎn)物中取10μl的DNA用于轉(zhuǎn)化，僅有2倍效率損失

• 為實現(xiàn)轉(zhuǎn)化，可通過柱離心或酚抽提和乙醇沉淀的方法純化DNA

• 適DNA用量比通常認為的要低，純化超螺旋pUC19的用量在100pg-1ng之間時轉(zhuǎn)化效率高。但是，隨著DNA用量增加至100ng，單次轉(zhuǎn)化反應(yīng)中得到的總克隆數(shù)也會增多

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