分子克隆實(shí)驗(yàn)專題--（五）感受態(tài)細(xì)胞的選擇與使用
常用感受態(tài)細(xì)胞的特性：
*0，DH5α：藍(lán)白斑篩選，克隆，質(zhì)粒抽提
JM110：甲基化酶缺陷型
SURE：克隆不穩(wěn)定插入片段，降低同源重組
DH10B：文庫(kù)構(gòu)建，長(zhǎng)片段質(zhì)粒的克隆（150kp
      質(zhì)粒轉(zhuǎn)化）
Stbl2：克隆不穩(wěn)定插入片段，正向重復(fù)，逆轉(zhuǎn)錄病毒序列，克隆甲基化基因組序列。
Stbl3：克隆慢病毒表達(dá)載體中的正向重復(fù)序列，降低逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中長(zhǎng)末端重復(fù)序列的非目標(biāo)同源重組。

?        選擇適宜的感受態(tài)細(xì)胞
       序列的結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)度，載體種類以及特殊要求等。
?        選擇適宜的轉(zhuǎn)化方式
       熱激轉(zhuǎn)化：常規(guī)克隆，片段較短（<10kb)
       電轉(zhuǎn)化: 建庫(kù)，基因敲除，長(zhǎng)片段（>10kb)

感受態(tài)細(xì)胞使用的注意事項(xiàng)

?        連接產(chǎn)物或質(zhì)粒的量
      效價(jià)：1μg標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆的數(shù)目，單位為cfu。
      化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞：106，107，108，109cfu
      電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞：108，109，1010cfu
      常規(guī)的克隆根據(jù)連接產(chǎn)物和質(zhì)粒的量選擇適當(dāng)效價(jià)的感受態(tài)細(xì)胞，特殊轉(zhuǎn)化（如建庫(kù)）則選擇感受態(tài)細(xì)胞，一般選用電轉(zhuǎn)。

?        感受態(tài)細(xì)胞效價(jià)測(cè)定
      標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒：pUC18, pUC19,pBR322
                        超螺旋，超純
      質(zhì)粒使用量：<5μl, <1ng
      設(shè)立陰性對(duì)照，多涂幾板(3塊以上）取平均值。
?        化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞的使用
       質(zhì)粒PCR擴(kuò)環(huán)的產(chǎn)物以及進(jìn)行體內(nèi)重組的線性片段不宜選用DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
       可能原因： DH5α本身不適合這種操作；感受態(tài)制備的試劑對(duì)于這種轉(zhuǎn)化有抑制作用。
        可選用*0感受態(tài)細(xì)胞。
?        電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞的使用
      盡量降低轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的離子濃度，防止細(xì)胞被擊穿。
      大量的連接產(chǎn)物提純后進(jìn)行轉(zhuǎn)化，或者進(jìn)行透析后再轉(zhuǎn)化，有些進(jìn)行體內(nèi)重組的酶切產(chǎn)物進(jìn)行提純后進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
?        氨芐平板的衛(wèi)星菌落
       氨芐平板涂板后如果時(shí)間太長(zhǎng)，就會(huì)產(chǎn)生衛(wèi)星菌落，在單克隆周圍生成小的克隆。
       氨芐抗生素只能抑制菌落生長(zhǎng)，而不能殺死，當(dāng)抗生素降解失效后，被抑制的菌體重新形成菌斑。
        解決方法：使用新鮮配置的氨芐培養(yǎng)基平板，提高氨芐的使用量，選用高質(zhì)量的氨芐抗生素。

?        感受態(tài)細(xì)胞的取用
       特殊制備的感受態(tài)細(xì)胞在超低溫條件下可以維持效價(jià)半年以上，在制成之后要立即放入超低溫冰箱。
       感受態(tài)細(xì)胞對(duì)溫度的變化非常敏感，取用時(shí)要快取快放，不能將整包的細(xì)胞放在外面然后取用。
       看清標(biāo)記，防止拿錯(cuò)。

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