人抗中性粒細胞核周抗體(pANCA)ELISA試劑盒實驗使用說明書

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　　人抗中性粒細胞核周抗體(pANCA)ELISA試劑盒的實驗使用說明書如下：

　　一、實驗目的

　　本試劑盒用于檢測人血清、血漿及相關液體樣本中人抗中性粒細胞核周抗體(pANCA)水平。

　　二、實驗原理

　　本試劑盒采用雙抗原夾心酶聯(lián)免疫法(ELISA)測定標本中人抗中性粒細胞核周抗體(pANCA)。用純化的抗原包被微孔板，制成固相抗原，可與樣品中抗中性粒細胞核周抗體(pANCA)相結合，經洗滌除去未結合的抗體和其他成分后再與HRP標記的抗原結合，形成抗原-抗體-酶標抗原復合物。經過洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中pANCA的含量呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值)，與CUTOFF值相比較，從而判定標本中人抗中性粒細胞核周抗體(pANCA)的存在與否。

　　三、樣本處理

　　?血清?：室溫血液自然凝固10~20分鐘，離心20分鐘左右(2000~3000轉/分)。仔細收集上清，保存過程中如出現沉淀，應再次離心。

　　?血漿?：應根據標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10~20分鐘后，離心20分鐘左右(2000~3000轉/分)。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次離心。

　　?尿液?：用無菌管收集，離心20分鐘左右(2000~3000轉/分)。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。

　　?細胞培養(yǎng)上清?：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右(2000~3000轉/分)。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時，用PBS(PH7.2~7.4)稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心20分鐘左右(2000~3000轉/分)。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。

　　?組織標本?：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。標本融化后仍然保?~8℃的溫度。加入一定量的PBS(PH7.4)，用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右(2000~3000轉/分)。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。

　　四、實驗步驟

　　?編號?：將樣品對應微孔按序編號，每板應設陰性對照2孔、陽性對照2孔、空白對照1孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同)。

　　?加樣?：分別在陰、陽性對照孔中加入陰性對照、陽性對照50μl。然后在待測樣品孔先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl。

　　?溫育?：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

　　?配液?：將30倍濃縮洗滌液加蒸餾水至600ml后備用。

　　?洗滌?：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。

　　?加酶?：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。

　　?溫育?：操作同3。

　　?洗滌?：操作同5。

　　?顯色?：每孔先加入顯色劑A 50μl，再加入顯色劑B 50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘。

　　?終止?：每孔加終止液50μl，終止反應(此時藍色立轉黃色)。

　　?測定?：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。測定應在加終止液后15分鐘以內進行。

　　五、結果判定

　　?試驗有效性?：陽性對照孔平均值≥1.00;陰性對照平均值≤0.10。

　　?臨界值(CUT OFF)計算?：臨界值=陰性對照孔平均值+0.15。

　　?陰性判定?：樣品OD值<臨界值(CUT OFF)者為抗中性粒細胞核周抗體(pANCA)陰性。

　　?陽性判定?：樣品OD值≥臨界值(CUT OFF)者為抗中性粒細胞核周抗體(pANCA)陽性。

　　六、注意事項

　　操作嚴格按照說明書進行，本試劑不同批號組分不得混用。

　　試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15~30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。

　　濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

　　底物請避光保存。

　　試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準，使用雙波長檢測時，參考波長為630nm。

　　所有樣品、洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。終止液為2M的硫酸，使用時必須注意安全。

　　七、保存條件與有效期

　　?保存條件?：2~8℃低溫冷藏。

　　?有效期?：6個月。

　　請嚴格按照說明書進行實驗操作，以確保實驗結果的準確性和可靠性。