Elisa實(shí)驗(yàn)：加酶標(biāo)抗體操作 本生生物公司供應(yīng)：ELISA試劑盒,動(dòng)物血清,熒光定量PCR耗材,移液器吸嘴,微量離心管,進(jìn)口凍存管,細(xì)胞培養(yǎng)皿,培養(yǎng)板,培養(yǎng)瓶,進(jìn)口吸頭,儀器及手套,色譜耗材,針頭過濾器等。

　　Elisa試劑盒操作步驟:

　　1. 包被過程(注意設(shè)置空白對照,陰性對照):

　　將所用抗原用包被稀釋液稀釋到適當(dāng)濃度(一般所需抗原包被量為每孔20-200μg),每孔抗原加入100μl, 置37℃,4h,或4℃,24h;棄去孔中液體.(為避免蒸發(fā),板上應(yīng)加蓋或?qū)迤椒旁诘撞坑袧窦啿嫉慕饘贊窈兄?

　　2. 封閉酶標(biāo)反應(yīng)孔:

　　5%小牛血清置37℃封閉40min.封閉時(shí)將封閉液加滿各反應(yīng)孔,并去除各孔中的氣泡,封閉結(jié)束后用洗滌液滿孔洗滌3遍,每遍3min.

　　洗滌方法:吸干孔內(nèi)反應(yīng)液,將洗滌液注滿板孔,放置2min略作搖動(dòng),吸干孔內(nèi)液,傾去液體后在吸水紙上拍干。洗滌次數(shù)3次

　　3. 加入待檢測樣品(建立合適的濃度梯度):

　　檢測時(shí)一般采用1:50-1:400的稀釋度, 應(yīng)采用較大稀釋體積進(jìn)行,一般保證樣品吸取量>20μl.

　　將稀釋好的樣品加入酶標(biāo)反應(yīng)孔中,每樣品至少加雙孔, 每孔100μl,置于37℃,40-60min.用洗滌液滿孔洗滌3遍,每遍3min.

　　4. 加入酶標(biāo)抗體:

　　酶標(biāo)抗體: 根據(jù)酶結(jié)合物提供商提供的參考工作稀釋度進(jìn)行. 37℃,30-60min之間.短于30min往往結(jié)果不穩(wěn)定.每孔加100μl.洗滌同前。

　　5. 加入底物液(現(xiàn)用現(xiàn)配):

　　選TMB-過氧化氫尿素溶液,OPD-過氧化氫底物液系統(tǒng)次之.

　　底物加入量:每孔100μl,置37℃避光放置3-5分鐘,加入終止液顯色.

　　6. 終止反應(yīng):

　　每孔加入終止液50μl終止反應(yīng),于20min內(nèi)測定實(shí)驗(yàn)結(jié)果.

　　7. 結(jié)果判斷:

　　OPD顯色后采用492nm波長,TMB反應(yīng)產(chǎn)物檢測需要450nm波長.檢測時(shí)一定要首先進(jìn)行空白孔系統(tǒng)調(diào)零.用測定標(biāo)本孔的吸收值與一組陰性標(biāo)本測定孔平均值的比值(P/N)表示,當(dāng)P/N大于2時(shí)作為抗體的效價(jià).(數(shù)值的大小依具體檢測要求而定.)