人NK細(xì)胞無(wú)血清無(wú)動(dòng)物成分培養(yǎng)基操作說(shuō)明

人NK細(xì)胞培養(yǎng)基（套裝）

人NK細(xì)胞無(wú)血清無(wú)動(dòng)物成分培養(yǎng)基操作說(shuō)明

【實(shí)驗(yàn)材料】

1. KXAcF擴(kuò)增液（1L，貨號(hào)：kx40-202）

2. 激活劑濃縮液（0.5ml，貨號(hào)：kx40-201）

3. 重組人白介素-2

4. 重組人白介素-15

5. 細(xì)胞培養(yǎng)瓶

6. 細(xì)胞培養(yǎng)袋

7. 人淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll-Hypaque，比重1.077g/ml）

8. 生理鹽水或PBS（PH 7.2）

9. 注射器及其它細(xì)胞培養(yǎng)用材料

【操作方法】

1. 激活劑預(yù)處理

  推薦的處理方案

注意：一般而言，臍血單個(gè)核細(xì)胞濃度是外周血的一倍左右。

      通常使用的臍血采集袋中含抗凝劑 28ml/袋

1. 吸取激活劑75ul，加至1個(gè)25cm²培養(yǎng)瓶中。加入PBS 5ml充分混勻，使液體分散在瓶底。
2. 吸取激活劑250ul，加至1個(gè)75cm²培養(yǎng)瓶中。加入PBS 10ml充分混勻，使液體分散在瓶底。
3. 或吸取激活劑500ul，加至1個(gè)175cm²培養(yǎng)瓶中。加入PBS 20ml充分混勻，使液體分散在瓶底。
4. 或吸取激活劑1ml，加至1個(gè)250cm²培養(yǎng)瓶中。加入PBS 40ml充分混勻，使液體分散在瓶底。

注：飽和濃度的激活劑利于NK細(xì)胞的特異性活化。

1. 4℃活化過(guò)夜；或置于4℃冰箱保存，可儲(chǔ)存2周。
2. 吸除激活劑，沿培養(yǎng)瓶側(cè)壁加入生理鹽水，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，使液體充分分散。特別強(qiáng)調(diào)：側(cè)壁加入生理鹽水。
3. 吸除生理鹽水，洗滌后的培養(yǎng)瓶應(yīng)立即使用。

提示：

• 使用PBS稀釋激活劑，可維持激活劑工作液的PH值，從而保證抗體與培養(yǎng)瓶底的充分結(jié)合
• 必要時(shí)，可在37℃條件下反應(yīng)至少1小時(shí)，但效果較差，常影響終NK細(xì)胞比例。增加激活劑活化時(shí)間，?？蛇_(dá)到較好的效果。

2. 外周血采集

準(zhǔn)備材料：50ml注射器，注射用肝素鈉溶液（2ml，12500U）

操作步驟：

1. 50ml注射器連接靜脈輸液針，去除輸液針保護(hù)套，抽取肝素鈉1ml浸潤(rùn)管壁，推出殘留液體。
2. 肘靜脈處皮膚消毒，抽取30-50ml外周血。
3. 套上輸液針保護(hù)套，在針頭近端將軟管打結(jié)封閉靜脈輸液針。
4. 核對(duì)姓名的信息，標(biāo)記。
5. 一次性鋪巾包裹注射器，至于血液標(biāo)本采集箱，室溫運(yùn)輸。
6. 3小時(shí)內(nèi)交給實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員。

3. 臍帶靜脈血采集

按照臍靜脈血采集常規(guī)，使用血液采集袋采集。

4. 單個(gè)核細(xì)胞分離、血漿采集及處理

1. 開(kāi)啟水浴箱，調(diào)整溫度至56℃以備滅活補(bǔ)體。
2. 采集常規(guī)外周血、臍帶血或G-CSF動(dòng)員的外周血。
3. 離心，500g，10分鐘，收集血漿。56℃，20-30分鐘滅活補(bǔ)體。
4. 稀釋血細(xì)胞，F(xiàn)icoll-Hypaque密度梯度離心，800g（2000rpm左右），30分鐘。
5. 在收集單個(gè)核細(xì)胞層之前，將血漿離心，800g，5分鐘以上，以去除其中的血小板。
6. 收取單個(gè)核細(xì)胞層，充分混勻。離心洗滌，500g，6-10分鐘（根據(jù)液體量調(diào)整）。
7. 再次離心洗滌，500g，6-10分鐘（根據(jù)液體量調(diào)整）。
8. 用KXAcF擴(kuò)增液懸浮細(xì)胞。
9. 取10ul細(xì)胞懸浮液，加入白細(xì)胞稀釋液90ul，或3%冰醋酸90ul，混勻后計(jì)細(xì)胞數(shù)。

5. 細(xì)胞培養(yǎng)

1)  單個(gè)核細(xì)胞懸液中加入IL-2，500-1000U/ml，IL-15，25-50ng/ml，自體血漿5-10%。細(xì)胞濃度調(diào)整至2*10⁶/ml，

A：細(xì)胞初始接種濃度是影響終NK細(xì)胞比例及細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)的關(guān)鍵因素之一。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，細(xì)胞終濃度2*10⁶/ml為宜。

B：某些外周血，血漿十分渾濁，其中的脂類(lèi)含量過(guò)高，不利于細(xì)胞增殖。可換用混合人AB血漿。

2)  將細(xì)胞懸液加入已經(jīng)預(yù)鋪板、且已經(jīng)洗滌一次的培養(yǎng)瓶中，37℃，5%CO2和100%濕度下培養(yǎng)。次日，觀察是否有污染現(xiàn)象；如無(wú)，繼續(xù)培養(yǎng)，無(wú)需反復(fù)觀察。

3)  72小時(shí)后，根據(jù)細(xì)胞密度，加入適量IL-2，500-1000U/ml，IL-15，25-50ng/ml，自體血漿10%的擴(kuò)增培養(yǎng)基。一般情況下，補(bǔ)充液體量為原體積的一倍。IL-2和IL-15按照補(bǔ)液后的總體積計(jì)算，血漿按照新培養(yǎng)基體積計(jì)算。

4)  繼續(xù)培養(yǎng)2天，培養(yǎng)液中補(bǔ)充適量含血漿5-10%，IL-2（500-1000U/ml）和IL-15（25-50ng/ml）的新鮮擴(kuò)增培養(yǎng)基。補(bǔ)液量一般為原體積的一倍。

5)  之后，每天觀察細(xì)胞集落大小及密度，及時(shí)補(bǔ)充含血漿、IL-2和IL-15的新鮮培養(yǎng)基。

提示：

A：早期細(xì)胞增殖速度較慢，這與NK細(xì)胞的特異性活化有關(guān)。一般而言，NK細(xì)胞占外周血淋巴細(xì)胞的比例為5-15%，NK細(xì)胞擴(kuò)增一倍，細(xì)胞總數(shù)只擴(kuò)增1.2倍。因此，早期細(xì)胞總數(shù)并不能反映細(xì)胞擴(kuò)增速度。

B：轉(zhuǎn)大瓶或轉(zhuǎn)袋培養(yǎng)是NK細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵步驟之一。經(jīng)過(guò)72小時(shí)培養(yǎng)后，部分NK細(xì)胞形成貼壁的集落；而且，這些貼壁的集落常分布于培養(yǎng)瓶底的邊沿。如經(jīng)5-6次吹打后，NK細(xì)胞集落未脫落，則在原培養(yǎng)瓶中加入含5-10%血漿、IL-2（500-1000U/ml）和IL-15（25-50ng/ml）的新鮮擴(kuò)增培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2-3天，則大部分集落可自行脫落。收集這些細(xì)胞，與其他細(xì)胞轉(zhuǎn)入大培養(yǎng)袋或大培養(yǎng)瓶中混合培養(yǎng)即可。

 附圖1.實(shí)際直徑接近或超過(guò)250um的NK細(xì)胞集落，集落貼壁生長(zhǎng)。

      尺寸：100um。

6）繼續(xù)培養(yǎng)，直至細(xì)胞總體積超過(guò)200ml，細(xì)胞數(shù)超過(guò)2x10⁸個(gè)。此時(shí)，可轉(zhuǎn)大培養(yǎng)袋培養(yǎng)，培養(yǎng)體積擴(kuò)大一倍。新鮮擴(kuò)增培養(yǎng)基中含IL-2（500-1000U/ml）和IL-15（25-50ng/ml）補(bǔ)充自體血漿。

7）每隔2-3天補(bǔ)充含新鮮的血漿及細(xì)胞因子的培養(yǎng)基，培養(yǎng)12-15天細(xì)胞，達(dá)到目的用量后，可進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)，之后收獲細(xì)胞。

提示：

A．每次補(bǔ)液時(shí)，均添加IL-15可提高NK細(xì)胞比例，但也增加了培養(yǎng)成本。

B．如在培養(yǎng)后期無(wú)自體血漿可用，可補(bǔ)充人AB血漿，但是需要滅活補(bǔ)體。

C．對(duì)于1.8L培養(yǎng)袋而言，如400ml培養(yǎng)基平鋪整個(gè)培養(yǎng)袋，則不能維系細(xì)胞間相互支持作用。建議折疊一半培養(yǎng)袋，使培養(yǎng)基集聚于另一半。依據(jù)經(jīng)驗(yàn)，這樣可更好的維系細(xì)胞的快速增殖。

6. 細(xì)胞收獲

1）將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管，計(jì)細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞活力。

2）將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至250ml離心管，離心收獲細(xì)胞，離心速度為1500rpm (500xg)，離心時(shí)間為10分鐘。

3）將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至50ml離心管，生理鹽水懸浮，離心洗滌2次，1500rpm (500xg)，6分鐘。

4）用含1%注射用人白蛋白的生理鹽水懸浮細(xì)胞。

5）70μm細(xì)胞篩過(guò)濾細(xì)胞。

1. 留小樣備質(zhì)檢。
2. 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至輸液袋中。靜置于室溫。

7. 注意事項(xiàng)

1）初始接種單個(gè)核細(xì)胞的濃度以及細(xì)胞的活性，不但影響終細(xì)胞群NK細(xì)胞比例，也影響培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞的活性。過(guò)低的單個(gè)核細(xì)胞接種濃度，細(xì)胞增殖速度慢；過(guò)高的濃度，終細(xì)胞群中NK細(xì)胞比例低。

2）在小培養(yǎng)袋或大培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，總體積200ml，細(xì)胞總數(shù)在2*10⁸以上時(shí)，方可轉(zhuǎn)入大培養(yǎng)袋。否則，細(xì)胞增殖速度慢，終細(xì)胞總數(shù)低。

3）體系中持續(xù)添加IL-15，可維系NK細(xì)胞優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增。

4）NK細(xì)胞增殖速度個(gè)體差異很大，轉(zhuǎn)大瓶或轉(zhuǎn)袋培養(yǎng)后，應(yīng)密切觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。由于NK細(xì)胞常呈集落形式增殖，細(xì)胞計(jì)數(shù)準(zhǔn)確不高。建議根據(jù)培養(yǎng)基顏色（由紅色變橙色），每10x10視野中實(shí)際直徑接近或大于250um的集落平均達(dá)到3-5個(gè)，即應(yīng)補(bǔ)加新鮮的擴(kuò)增培養(yǎng)基。同樣，培養(yǎng)基中應(yīng)添加適量血漿、IL-2和IL-15.

附圖2.培養(yǎng)基顏色和集落大小，是決定換液及換液量的關(guān)鍵因素。左圖：左側(cè)為剛補(bǔ)液的培養(yǎng)基顏色，右側(cè)為需要補(bǔ)液的液體顏色。右圖：a和b:大集落；c和d:小集落。