深受研究人員歡迎的CRISPR-Cas13a蛋白

導讀：CRISPR是一種出色的基因組編輯工具，深受研究人員的歡迎。其中，大家比較熟悉的是來自化膿鏈球菌的Cas9（SpCas9）。不過，這并不是wei一的選擇。一種新型核酸酶Cas13a（以前稱為C2c2）正逐漸走進人們的視野，它具有*的性質，進一步擴展了CRISPR工具箱。在此，我們將介紹一下Cas13a的*性質以及各種應用。

Cas蛋白的分類

根據Cas蛋白的分類和效應復合物的性質主要分為兩大類Class 1和Class 2，六種不同類型。
1類系統(tǒng)包括類型I、III、IV，效應復合物由多個Cas蛋白 （具有一個或多個內切酶活性組分） 組成并與crRNA緊密結合，
2類系統(tǒng)包括類型II、V和VI，只有一個具有內切酶活性的多結構蛋白。
II類CRISPR-Cas系統(tǒng)CRISPR/Cas9系統(tǒng)已用于基因敲除和敲入以及基因組標記等,方便基因操作和基因組研究。
而VI類系統(tǒng)又叫CRISPR-Cas13系統(tǒng)，是向導RNA介導的RNA靶向的內切酶系統(tǒng)，從15年被發(fā)現至今一共鑒定出四個亞型：
VI-A(Cas13a/C2c2),VI-B(Cas13b),VI-C(Cas13c)和VI-D(Cas13d)
已經開始運用于RNA的敲低，RNA定點編輯，RNA檢測以及RNA剪接調控

Cas13a的*之處

Cas13a初是由Broad研究所的研究人員發(fā)現的。2015年，Shmakov及其同事利用Cas1作為“誘餌”，來鑒定細菌基因組中與CRISPR相關聯(lián)的蛋白。通過此次分析，他們鑒定出53個候選基因，總共分成三大類：C2c1、C2c2和C2c3。C2c1和C2c3與Cpf1有些類似，不過它們需要tracrRNA和crRNA才能切割DNA目標，而Cpf1僅需要crRNA。

再來看C2c2（也就是Cas13a）與Cas9的區(qū)別。大的區(qū)別在于Cas13a結合并切割RNA，而Cas9切割DNA。從結構上來看，Cas13a含有兩個HEPN結構域，而Cas9用HNH和RuvC結構域來切割DNA目標。HEPN結構域對Cas13a切割RNA目標是必需的。另外，與Cas9類似，Cas13a分子中關鍵殘基的突變可以形成核酸酶活性缺失的Cas13a（dCas13a），它能夠結合RNA目標但無法切割。

表1：比較常用的CRISPR酶

Cas13a的作用機制

大家都知道，Cas9利用tracrRNA和crRNA來實現與DNA目標的結合和切割。不過，Cas13a只需要24個堿基的crRNA，它通過富含尿嘧啶的莖環(huán)結構與Cas13a分子相互作用，并通過Cas13a的一系列構象變化來促進目標的切割。與Cas9一樣，Cas13a也能容忍crRNA與目標序列之間的單個錯配，不過若存在2個錯配，那切割效率就大大降低。它的PFS序列（相當于PAM序列）位于間隔區(qū)的3’端，由A、U 或C堿基組成。

Cas13a還有一個特別之處，那就是Cas13a一旦識別并切割由crRNA序列的RNA目標，它就轉入了一種酶促“激活”狀態(tài)，這時它將結合并切割其他的RNA，而不管它們是否與crRNA同源，或是否存在PFS。這一點與Cas9截然不同。對于細菌而言，這種性質是有意義的。若細菌被噬菌體感染，它能夠激活程序性細胞死亡或休眠狀態(tài)，以限制感染在整個群體中的傳播。

Cas13a的潛在應用

那么，Cas13a可以應用在哪些方面呢？對于初學者來說，Cas13a可用來結合和切割RNA目標，不過這方面的應用可能受限，因為一旦目標被破壞，Cas13a就會失去控制。因此，Cas13a的突變體研究有望成為新的熱點，使其特異切割RNA目標，但是隨后不會切割非特異的RNA。此外，人們可利用dCas13a來分離群體中的特定RNA序列，或利用熒光標記的dCas13a來研究活細胞中的RNA加工。

近，張鋒實驗室還發(fā)表了一篇文章，證明了Cas13a可以高特異性地檢測RNA單分子。他們開發(fā)出的SHERLOCK系統(tǒng)可檢測血清、尿液和唾液中低濃度的寨卡病毒，并確定病毒載量，區(qū)分不同病毒株。它還可以對人類DNA進行基因分型，并鑒定游離DNA中的腫瘤突變。未來，Cas13a有望繼續(xù)擴大CRISPR的應用范圍。田克恭團隊建立了新方法：Crispr-Cas13a可視化檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)