羥基自由基清除能力測試試劑盒

（A004-96T）

一、測定原理

金屬離子與過氧化氫通過芬頓反應(yīng)生成的羥基自由基（•OH），•OH攻擊脫氧核糖并破壞其環(huán)呋喃環(huán)生成丙二醛（MDA）。丙二醛與2-硫代巴比妥酸（TBA）結(jié)合后在532nm處具有大吸收峰（Halliwell等，1987，ANAL BIOCHEM）。具體反應(yīng)如下：

Fe³⁺-EDTA+ 抗壞血酸→ Fe²⁺-EDTA +氧化的抗壞血酸(1)

Fe²⁺-EDTA + H₂O₂ → OH- + •OH +Fe³⁺-EDTA (2)

•OH + 脫氧核糖→ 脫氧核糖碎片 MDA (3)

MDA + 2TBA → 發(fā)色體(4)

專一的羥基自由基抗氧化劑能減少羥基對脫氧核糖的攻擊，從而減少MDA產(chǎn)生而使發(fā)色體減少。通過測定反應(yīng)終產(chǎn)物的吸光值即可判斷受測樣品的羥基自由基清除能力。

二、試劑組成

試劑一：液體，2mL；

試劑二：液體，2mL；

試劑三：液體，2mL；

試劑四：液體，2mL；

試劑五A：液體，100mL；

試劑五B：淡黃色粉末；

試劑六：液體，100mL；

標(biāo)準(zhǔn)品：體系終濃度為10mM的甘露醇（雙蒸水配制），10mL。

三、儲存條件及有效期

試劑盒-20℃可保存1個月。

四、試劑的配制

試劑一應(yīng)用液：待試劑融化后，在試劑一瓶中加入18mL雙蒸水，搖勻待用；

試劑二應(yīng)用液：待試劑融化后，在試劑二瓶中加入18mL雙蒸水，搖勻待用；

試劑三應(yīng)用液：待試劑融化后，在試劑三瓶中加入18mL雙蒸水，搖勻待用；

試劑四應(yīng)用液：待試劑融化后，在試劑四瓶中加入18mL雙蒸水，搖勻待用；

試劑五應(yīng)用液：待試劑五A融化后，將試劑五B全部倒入試劑五A中，充分搖勻溶解（若發(fā)現(xiàn)不好溶解，可超聲波助溶或適當(dāng)加熱。如不易觀察是否全部溶解，可將試劑五A倒入燒杯中，配制好后再倒回試劑五A瓶內(nèi)，避光保存）；

試劑六：直接使用；

標(biāo)準(zhǔn)液：根據(jù)實際需要，采用雙蒸水稀釋使用。

所有試劑均需現(xiàn)配現(xiàn)用！

五、操作步驟

充分混勻，37℃水浴30min使之充分反應(yīng)。

充分混勻，100℃沸水浴15min²。

冷卻后進行比色讀數(shù)。如您具有可以測定532nm處吸光值的酶標(biāo)儀，可從反應(yīng)液中取出200μL于酶標(biāo)板內(nèi)采用酶標(biāo)儀讀數(shù)；或者您也可以采用分光光度計測定532nm處吸光值。

¹如樣品顏色較淺可不做樣品空白（即認為值為0）；

²建議反應(yīng)15min，也可適當(dāng)延長或縮短時間至10-20min，但同一批樣品加熱時間需保持一致。

六、注意事項

1. 如樣品中色素物質(zhì)不是分析對象，建議先進行脫色處理，處理后樣品可不做對照孔；

2. 如不確定樣品的羥基自由基清除能力，可先做不同濃度的稀釋液進行摸索，并選擇適宜濃度進行測定，高濃度下，濃度與清除率間并不線性相關(guān)。注意，產(chǎn)物的不同自由基清除能力可能相差很大，可能一個化合物的超氧陰離子自由基清除能力特別好，IC50可以低于10μg/mL，但羥基自由基清除能力很差，IC50達到10mg/mL，或者根本沒有清除能力；

3. 混勻很重要，建議每加一種試劑時均充分混勻。

4. 100℃沸水浴可采用水浴鍋或者電磁爐進行加熱。加熱時可用錫紙蓋住試管管口，并用牙簽戳一個小孔。若使用一次性離心管進行實驗，切記不可將上蓋蓋死，氣體膨脹有爆裂危險！

5. 加樣順序不可顛倒！不可將試劑一至四混勻后加入樣品；

6. 本測試盒部分試劑對皮膚有一定傷害，請戴手套操作。在沸水浴時小心蒸汽燙傷；

7. 煮沸加熱時間和溫度對本測試至關(guān)重要，請務(wù)必保證所有測試管加熱時間和溫度均相同。同時請務(wù)必等待樣品冷卻到室溫時再進行讀數(shù)測定，如需快速冷卻，可采用自來水沖洗試管外壁的方法；

8. 測定羥基自由基的方法總類繁多（Halliwell等，1988，Methods of Biochemical Analysis），同一樣品采用不同方法測定時會有一定差異，因此不同方法測定的結(jié)果不能簡單比較；

9. 本測試樣品一般不可采用有機溶劑溶解！極少量也不可以！常見的有機溶劑如乙醇等，其通過本方法得到的羥基自由基清除率*，超過許多常見抗氧化劑，不可以忽略。不可使用的有機溶劑及機理參見文獻：Xican Li, 2013, Food Chemistry.