大腸桿菌中的蛋白在IPTG誘導下的表達操作步驟

蛋白的重組表達是指將外源基因克隆在含有特定啟動子的表達載體中，讓其在大腸桿菌中在IPTG的誘導下過量表達。

蛋白質純化的第一步是在細胞宿主中表達蛋白質。制備的pET28-His6-GFP含有iptg誘導的His6-GFP。一旦細胞開始生長，將通過添加IPTG“誘導"它們制造蛋白質。然后將讓它們繼續(xù)生長并生產蛋白質幾個小時，然后通過離心收集細胞。

材料

1mL過夜培養(yǎng)的由pET28-His6-GFP轉化的BL21細胞

1000X 卡那霉素原液

100M IPTG儲備液

50mL液體LB培養(yǎng)基

步驟

1. 在50mL LB中加入1000X卡那霉素，使最終濃度為1X。攪拌均勻。

2. 將過夜培養(yǎng)液1:100稀釋到50mL LB中，并加入1X卡那霉素。在37°C搖晃培養(yǎng)。定期取1mL樣品檢查OD600(測量細菌濃度)。

3. 當OD600達到0.6-1.0(大約2小時)時，將IPTG加入，最終濃度為500µM。這將誘導His6-GFP蛋白的表達。

4. 將培養(yǎng)液在37°C搖晃16-24小時，使其生長并表達GFP。請注意，在某些情況下，誘導后降低溫度可能有助于蛋白質折疊。

5. 16-24小時后，將培養(yǎng)液倒入50mL錐形管中。

6. 將顆粒細胞在離心機中以4000g旋轉10分鐘。記得要平衡離心機!

7. 將上清液倒入廢液容器中(靠近水槽)。我們將漂白介質，以確保介質中殘留的細菌在排入下水道之前被殺死。

8. 冷凍細胞顆粒，直到準備好開始蛋白質純化。