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當(dāng)前位置:上?;菡\生物科技有限公司>>技術(shù)文章>>RPA等溫擴(kuò)增技術(shù)特征及與PCR優(yōu)勢是什么
RPA(recombinase polymerase amplification)即重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù),在ATP存在條件下,重組酶與引物結(jié)合, 形成蛋白-核酸聚合體,并搜索配對目標(biāo);當(dāng)引物尋找到配對DNA模板,ATP水解供應(yīng)能量,重組酶離開引物,并在DNA聚合酶的作用下合成新DNA鏈;同時,單鏈DNA結(jié)合蛋白( SSB)同被置換出來的DNA單鏈進(jìn)行結(jié)合,防止DNA模板再次形成雙鏈。RPA實驗?zāi)茉诤愣囟认逻M(jìn)行全程實驗,沒有復(fù)雜的操作,對儀器及人員的要求不高,適合基層或現(xiàn)場快速診斷。
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RPA等溫擴(kuò)增原理
1. 復(fù)合物A能夠在單鏈上尋找同源序列,并連接成環(huán)狀分子。
2. 單股DNA結(jié)合蛋白可以與單鏈DNA結(jié)合,防止其二級結(jié)構(gòu)形成,并引導(dǎo)聚合酶與模板結(jié)合。
3. DNA聚合酶負(fù)責(zé)在模板上合成新鏈DNA。
RPA的優(yōu)勢在于其等溫反應(yīng)、快速擴(kuò)增和魯棒性,這使其非常適合POCT檢測。
RPA具有以下主要特征
1. 等溫反應(yīng)
RPA反應(yīng)在常溫(37-42°C)下進(jìn)行,不需要熱循環(huán)設(shè)備,這使其可以應(yīng)用于簡易的POC診斷裝置中。
2. 快速反應(yīng)
RPA反應(yīng)只需要20-40分鐘,比PCR快幾倍,這可實現(xiàn)病原體 DNA的快速檢測。
3. 強(qiáng)大的擴(kuò)增效率
RPA可以從少量模板DNA復(fù)制出109-1011個拷貝,擴(kuò)增效率高達(dá)90%。
4. 高度特異性
RPA使用三個核酸酶(活動的復(fù)合體A、單股DNA結(jié)合蛋白及DNA聚合酶)實現(xiàn)序列特異性擴(kuò)增,可檢出少至幾個拷貝的目標(biāo)DNA。
5. 魯棒性
RPA可以在各種樣本中直接擴(kuò)增(不需DNA精制),對PCR的常見阻礙因素如血清、肉湯等也具有很好的耐受性。
6. 靈活性
RPA可直接從各種原始樣本中擴(kuò)增DNA,也可以與其他技術(shù)如磁珠分離等結(jié)合,實現(xiàn)樣本的預(yù)處理。
RPA與PCR相比具有以下主要優(yōu)勢
1. 等溫反應(yīng)
RPA在常溫下進(jìn)行,而PCR需要進(jìn)行多輪的溫度變化循環(huán),需要PCR儀等設(shè)備。RPA的等溫反應(yīng)更簡單,不需要昂貴設(shè)備,這有利于POC檢測的應(yīng)用。
2. 速度更快
RPA反應(yīng)只需20-40分鐘,而PCR通常需要2-3小時。RPA可以實現(xiàn)病原DNA的快速檢測,適用于臨床急癥檢測。
3. 更高擴(kuò)增效率
RPA可以得到109-1011拷貝的擴(kuò)增產(chǎn)物,擴(kuò)增效率高達(dá)90%,而PCR的擴(kuò)增效率一般在80-90%之間。
4. 魯棒性更強(qiáng)
RPA可以直接從各種原始樣本擴(kuò)增,而PCR更加敏感,常需進(jìn)行DNA精制或分離。RPA對PCR的常見干擾因子也更具耐受性。
5. 不產(chǎn)生二級片段
RPA擴(kuò)增產(chǎn)物為單一片段,而PCR可能產(chǎn)生二級擴(kuò)增片段,影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。
RPA也存在一定局限
1. 目前報道較少:與PCR相比,RPA的研究報道和應(yīng)用案例還比較少,相關(guān)技術(shù)和產(chǎn)品也較不成熟,有待進(jìn)一步推廣。
2. 專一性較差:RPA的擴(kuò)增效率高,但其對非靶DNA的擴(kuò)增也較PCR更明顯,這會產(chǎn)生更高的假陽性信號,影響檢測精度。
3. 擴(kuò)增片段較長:RPA獲得的擴(kuò)增片段一般在100-1500bp之間,較PCR獲得的產(chǎn)物長,不利于某些下游檢測。
4. 定量性較弱:與實時熒光PCR相比,RPA的定量能力較差,不利于獲得準(zhǔn)確的DNA定量結(jié)果。
RPA相比PCR,由于其等溫、快速、高效和魯棒等優(yōu)勢,更適用于簡易POCT檢測的應(yīng)用。但其專一性較差、擴(kuò)增片段較長和定量性較弱等也是不容忽視的局限因素。
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