生物素-親和素免疫放大技術(shù)

生物素及其活化生物素經(jīng)活化后，可容易地與各種抗原、抗體、酶及核酸分子中相應(yīng)基團(tuán)偶聯(lián)形成生物素化標(biāo)記物。

①標(biāo)記蛋白質(zhì)氨基的活化生物素 <N-羥基琥珀酰亞胺生物素BNHS(biotiny-n-hydroxy-succinimide,bnhs)>

 此種活化生物素的制備方法是將生物素與N－羥基丁二酰胺在碳二亞胺的作用下進(jìn)行縮和，生成生物素N－羥基丁二酰亞胺酯（biotiny-N-hydroxy-succinimide，BNHS）。BNHS分子酯健中的-C=O基團(tuán)可與蛋白質(zhì)分于中賴氨酸的氨基形成肽鍵，從而使蛋白質(zhì)標(biāo)記上生物素。若蛋白質(zhì)含賴氨酸殘基多，且等電點(diǎn)PI＞6時(shí)，標(biāo)記效果好。因此，BNHS適用于對抗體和中性或偏堿性抗原的生物素標(biāo)記。

生物素的分于量較小，當(dāng)與抗體或酶反應(yīng)形成生物素標(biāo)記結(jié)合物后．由于大分子蛋白的空間位阻效應(yīng)（steric hindrance），可對生物素與親和素間的結(jié)合以及BAS的應(yīng)用效果造成干擾?？赏ㄟ^在生物素分子側(cè)鏈上連接一定數(shù)量的基團(tuán)，形成連接臂，增加生物素與被標(biāo)記大分子間的距離（如長臂活化生物素），減少位阻效應(yīng)，增加檢測的靈敏度和特異性。

長臂活化生物素（N-hydroxy-succinimido-6-biotinyl amido hexanoate，BCNHS）是在生物素和N—羥基丁二酰亞胺之間添加了兩個6-氨基己糖分子基團(tuán)，形成連結(jié)臂，使其與抗體、酶等生物大分子結(jié)合后，不受位阻效應(yīng)的影響，更易發(fā)揮生物索的活性作用。BCNHS的制備是先用6－氨基己糖與生物素連接制得長臂生物素，然后再將其活化。

②標(biāo)記蛋白質(zhì)醛基的活化生物素  生物素酰肼（biotin hydrazine，BHZ）和肼化生物胞素（biocyin hydrazine，BCHZ）
BHZ是水合肼（hydraine hydrate）與生物素的合成物，主要用于偏酸性糖蛋白的生物素標(biāo)記。也可在BHZ側(cè)鏈上添加一個賴氨酸基團(tuán)作為連結(jié)臂，減少標(biāo)記后的空間位阻，使活化后的生物素能更好地與親和素結(jié)合。

生物胞素（biocytin）是生物素通過-C=O基與賴氨酸的ε－氨基連接而成的化合物，它與無水(空格)肼反應(yīng)后形成的肼化物即為肼化生物胞素（biocytin hydrazine，BCHZ）。BCHZ除可與蛋白質(zhì)的醛基結(jié)合外，它還與BNHS相同，能與蛋白質(zhì)的氨基結(jié)合，因此其適用范圍較BHZ寬。

③標(biāo)記蛋白質(zhì)巰基的活化生物素 3-(N-Maleimidylpropionyl)biocytin3-(N-馬來酰亞胺-丙酰)-生物胞素[3-(N-maleimido-propiny)-biocytin,MPB]

能特異地與蛋白質(zhì)巰基結(jié)合的活化生物素試劑。它是用氯化生物胞素與3-（N-馬來酰亞胺-丙酰）-N-BNHS在二甲基甲酰胺（DMF）溶液中反應(yīng)后制得的。

④標(biāo)記核酸的活化生物素

活化生物素可通過缺口移位法化學(xué)偶聯(lián)法、光化學(xué)法及末端標(biāo)記法等技術(shù)使生物素的戊酸側(cè)鏈通過酰胺健與核酸分子相連構(gòu)成生物索標(biāo)記的核酸探針。常用于標(biāo)記核酸分子的活化．常用于標(biāo)記核酸的活化生物素有以下幾種：

1.光生物素（photobiotin）
光生物素是一種化學(xué)合成的生物素衍生物。生物素分子側(cè)鏈上連接的芳香基疊氮化合物基團(tuán)具光敏感性，在一定波長的光照射下，光敏基團(tuán)可轉(zhuǎn)變?yōu)榉枷慊趸蕉苯优c腺嘌呤N7位氨基結(jié)合，形成生物素化的核酸探針，用于DNA或RNA的標(biāo)記。

2.生物素脫氧核苷三磷酸
先將生物索與某種脫氧枝苷酸連接成活化生物素，如生物素化dUTP（Bio-11-dUTP）。Bio-1l-dUTP作為TTP的結(jié)構(gòu)類似物，可采用缺口移位法通過DNase和DNA聚合酶Ⅰ的作用而摻人到雙鏈DNA中。

3.BNHS和BHZ二者均可以在一定條件下與核酸胞嘧啶分子中的N4氨基交聯(lián)，使核酸分子生物素化。

采用BNHS和BHZ活化生物素標(biāo)記核酸時(shí)，生物素偶聯(lián)的胞嘧啶N4氨基，是堿基互補(bǔ)時(shí)胸嘧啶與鳥嘌呤核苷酸形成氫鍵的基團(tuán)，該位置連接生物素后，可影響氫鍵的形成，因此目前常用光生物素和生物素化dUTP作為標(biāo)記核酸的活化生物素。