C004-96T 酶標(biāo)板法

總谷胱甘肽含量測定試劑盒（超微量型）-C004-96T 酶標(biāo)板法

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總谷胱甘肽含量測定試劑盒超微量型酶標(biāo)板法

一、測定原理

該測定基于谷胱甘肽（GSH）與5,5'-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）(簡稱：DTNB)反應(yīng)，產(chǎn)生在412 nm處具有大吸光值的5'-硫代-2-硝基苯甲酸（TNB）發(fā)色團(tuán)和氧化谷胱甘肽-TNB加合物（GS-TNB），且在412nm處TNB的形成速率與樣品中GSH的濃度成比例。在NADPH存在下，谷胱甘肽還原酶（GR）可將氧化型谷胱甘肽（GSSG）還原為2GSH，所以測量的谷胱甘肽量代表樣品中還原和氧化型谷胱甘肽含量的總和（[T-GSH]=[GSH] + 2×[GSSG]），該含量通常也被認(rèn)為是樣品中總谷胱甘肽含量。

本試劑盒也可測定還原型谷胱甘肽含量。
二、試劑組成
試劑一：液體20mL ×1瓶
試劑二A：液體500μL ×1瓶
試劑二B：液體 500μL ×1瓶
試劑三：液體500μL ×1瓶
試劑四: GSH標(biāo)準(zhǔn)品（粉劑15.7mg × 2管）
稀釋液：50mL ×1瓶
三、儲存條件及有效期
試劑盒-20℃可避光保存3個月。
四、試劑配制
試劑一工作液：將試劑一用純水稀釋10倍使用；
試劑二工作液：將試劑二B加入到試劑二A中，再加入9mL稀釋液，充分混勻，避光冰上保存，現(xiàn)配現(xiàn)用；
試劑三工作液：在試劑二中加入4.5mL稀釋液，避光冰上保存，現(xiàn)配現(xiàn)用；
試劑四工作液:將試劑四的一管粉末用100mL純水溶解，得到濃度為512μmol/L的GSH溶液。取50μL的512μmol/L的GSH溶液，用4.95mL的稀釋液稀釋得濃度為 5.12μmol/L的GSH溶液。然后進(jìn)行一系列的二倍稀釋，后得到0，0.08，0.16，0.32，0.64，1.28，2.56，5.12μmol/L的GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度。
五、樣品準(zhǔn)備
樣品前處理和保存對獲得正確的GSH濃度至關(guān)重要，請仔細(xì)閱讀本部分內(nèi)容后開始測定操作。不同類型的樣本處理方式不同，常見樣本處理方法如下：
A)貼壁細(xì)胞
選取70-80%融合的細(xì)胞（或用戶根據(jù)實(shí)際情況確定），采用冰冷的PBS潤洗兩次，并采用胰酶消化，消化液采用*培養(yǎng)基中和胰酶后，1000g，4℃離心5min，去除上清并采用冰冷的PBS潤洗沉淀，采用1mL試劑一重懸沉淀，冰上超聲破碎細(xì)胞，破碎后的細(xì)胞可離心去除沉淀，-80℃保存待用或立即進(jìn)行GSH測定。
B)懸浮細(xì)胞
離心收集細(xì)胞并采用冰冷的PBS潤洗兩次，采用1mL試劑一重懸沉淀，冰上超聲破碎細(xì)胞，破碎后的細(xì)胞可離心去除沉淀，-80℃保存待用或立即進(jìn)行GSH測定。
C)組織樣
將組織在適量試劑一中勻漿（通常組織樣：試劑一為1：10，w/v），4℃，8000g離心10min，取上清立即進(jìn)行GSH測定。
D)血漿
抗凝血漿1000g，4℃離心10min，將上層液體移入一新離心管中，加入等體積的試劑一，8000g，4℃離心10min，將上清液移入一新離心管中，立即進(jìn)行GSH測定。
本試劑盒檢測限非常低，一般不需要進(jìn)行樣本濃縮。如樣本GSH含量高于標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，可用稀釋液適當(dāng)稀釋后測定。
六、操作步驟

充分混勻，412nm下快速測定吸光值A(chǔ)0，五分鐘后412nm下再次測定吸光值A(chǔ)1
七、計算方法
1、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
以GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度0，0.08，0.16，0.32，0.64，1.28，2.56，5.12μmol/L為橫坐標(biāo)，以酶標(biāo)儀測得的吸光值差（A1-A0）為縱坐標(biāo)，利用軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過軟件計算得到一個一元一次方程，一般認(rèn)為相關(guān)系數(shù)（R2）大于0.99可用。
實(shí)測得標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)與作圖如下：
標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μmol/L）    A0             A1               A1-A0
                       0             0.0820     0.1320          0.0500
                       0.08 0.    0890        0.1480          0.0590
                       0.16        0.0930     0.1730          0.0800
                       0.32        0.0980     0.2080          0.1100
                       0.64        0.1040     0.2800          0.1760
                       1.28        0.1200     0.4440          0.3240
                       2.56        0.1450     0.7500          0.6050
                       5.12        0.2140     1.4240          1.2100

2、計算樣品濃度
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求樣品濃度。例如，小明測得某血清數(shù)據(jù)如下

將A1-A0的數(shù)值帶入方程y = 0.2270x + 0.0385中的y，求x，得到S1、S2樣品的GSH濃度分別為0.5617μmol/L和0.3855μmol/L。
八、注意事項
1. 實(shí)驗試劑中含有酶，對溫度敏感，建議實(shí)驗盡可能在碎冰上操作。
2. 本方法靈敏度高，可測定低至0.01μmol/L的谷胱甘肽。
推薦標(biāo)曲范圍0.08-5.12μmol/L，但實(shí)測在0.01-10.24μmol/L濃度范圍內(nèi)，標(biāo)曲的相關(guān)系數(shù)能達(dá)到0.998以上。具體標(biāo)曲范圍請用戶樣品預(yù)估濃度進(jìn)行判斷。
3. GSH濃度過高會超出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，務(wù)必稀釋后進(jìn)行測定。
4. 反應(yīng)時間對本測試影響極大，請務(wù)必保證樣本和標(biāo)準(zhǔn)品A1和A0間間隔時間*（5min）。如用戶酶標(biāo)儀具備酶促動力學(xué)讀數(shù)功能，建議使用該功能，設(shè)置間隔時間為5min自動讀數(shù)。
5. 加完試劑三后反應(yīng)會立即開始，請務(wù)必迅速進(jìn)行讀數(shù)。因此不建議用戶一次操作太多樣品，推薦一次加樣在8孔以內(nèi)為宜。
6. 本反應(yīng)進(jìn)行過程中吸光值線性上升，因此用戶如果樣本谷胱甘肽濃度過大或者過小，可以自由設(shè)定測定A0、A1間的間隔時間，一般推薦設(shè)定在2-10min間。但需注意的是，您需要根據(jù)時間自行摸索標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍。
7. 用戶也可每30s測定一次吸光值，并依據(jù)5min內(nèi)的測定值（11個點(diǎn)）作出一條直線并求得直線斜率，并根據(jù)斜率做出標(biāo)準(zhǔn)曲線和計算樣品濃度，該方法較本試劑盒推薦方法（終點(diǎn)法）更為準(zhǔn)確，但操作難度和計算量大，供有需求的用戶選用。
8. 本說明書給出的標(biāo)準(zhǔn)曲線僅為本公司一次試驗測定得到，為方便說明計算方法而給出。由于每次試驗加樣時間都存在差異，不同批次間的試劑也有一定差別，用戶切勿直接套用本說明書給出的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
9. 樣品前處理方法對測定出的樣品中GSH含量影響極大，所有樣品均應(yīng)盡量采用新鮮樣品，關(guān)于本文未提及的樣品處理方法，可通過E-mail向我司咨詢。