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PCR反應體系,有哪些?
閱讀:7350 發(fā)布時間:2021-8-4PCR板是一種在聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction ,PCR)中主要作為參與擴增反應的引物、Taq DNA聚合酶、dNTP、模板核酸、Mg、緩沖液等的承載物。
PCR反應體系:
1. 緩沖液
標準的緩沖液含 1pmol/ml Tris ·HCl,其 pH 為 8.3-9.0(室溫),而在延伸溫度(72 ℃)下,pH 值接近 7.2 。緩沖液中含有一種二價陽離子,用于激活 DNA 聚合酶的活性中心,一般使用 Mg2+。
2.dNTP
脫氧核糖核苷三磷酸的縮寫,是包括 dATP, dGTP, dTTP, dCTP 等在內(nèi)的統(tǒng)稱,即合成新的 DNA 鏈的材料。4 種 dNTP 的濃度相等,總濃度一般為 200pmol/ml (即飽和濃度)。dNTP 可與 Mg2+ 結(jié)合,使游離的 Mg2+ 濃度下降,影響 DNA 聚合酶的活性。
3. 引物
引物是一段短的單鏈 DNA 片段,可結(jié)合在核酸鏈上與之互補的區(qū)域,其功能是作為核苷酸聚合作用的起始點,DNA 聚合酶可由其 3′端開始合成新的核酸鏈。引物長度一般以 18~30bp 為宜,過短則降低特異性,過長則會引起引物間的退火而影響有效擴增,同時也增加引物合成的成本。引物的堿基順序不能與非擴增區(qū)有同源性。
4. 模板
模板是一段單鏈或者雙鏈 DNA,提供用于進行 PCR 擴增的原始信息。對模板的純度要求低,但不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA 聚合酶抑制劑、DNA 結(jié)合蛋白等。模板 DNA 應該盡量保持低溫保存。
5.Taq DNA 聚合酶
Taq DNA 聚合酶以 DNA 為復制模板,從將 DNA 由 5' 端點開始復制到 3' 端的酶。DNA 聚合酶的主要活性是催化 DNA 的合成(在具備模板、引物、dNTP 等的情況下)及其相輔的活性。必須一直保存于-20℃,內(nèi)含甘油保存。最適反應溫度 72 ℃,即延伸溫度。通常在配制 PCR 體系的最后加入。
材質(zhì):
其本身材質(zhì)在當今主要以聚丙烯(PP)為主,能更好適應PCR反應過程中反復高低溫設定,并且能夠?qū)崿F(xiàn)高溫高壓滅菌操作。為配合排槍、PCR儀等實現(xiàn)高通量操作,較常使用的為96孔或384孔的PCR板。板型符合SBS國際標準,且為適應不同廠家的PCR儀,根據(jù)裙邊設計又可分為無裙邊、半裙邊、升裙邊和全裙邊四種設計模式。
常見顏色:
有透明和白色,其中白色更適合用于新型的實時熒光定量PCR。
用途:
廣泛應用于遺傳、生化、免疫、醫(yī)藥等領(lǐng)域,不僅應用于基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎研究,還可用于疾病的診斷或任何有DNA,RNA的地方,屬于實驗室一次性易耗品。