膜聯(lián)蛋白 V  （或膜聯(lián)蛋白 A5）是胞內(nèi)蛋白磷脂結(jié)合膜聯(lián)蛋白家族的成員。在流式細(xì)胞術(shù)和熒光顯微鏡中，膜聯(lián)蛋白 V 常用于檢測凋亡細(xì)胞，因?yàn)樗軌蛞遭}依賴性方式特異性結(jié)合磷脂酰絲氨酸 (PS)。該方法由 Koopman 等人首先報(bào)道。 （1994）[1]。

在健康細(xì)胞中，PS 通常保留在質(zhì)膜的內(nèi)層。細(xì)胞凋亡早期伴隨著膜磷脂不對稱性的喪失，導(dǎo)致細(xì)胞表面PS暴露。這種易位是由 Xkr8 擾亂酶被效應(yīng)器 caspase-3 裂解后激活所介導(dǎo)的。與碘化丙啶 (PI) 等活體染料結(jié)合使用，熒光染料標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白 V 可以區(qū)分健康 (Annexin ? PI ? )、凋亡 (Annexin + PI ? ) 和壞死 (Annexin + PI + ) 細(xì)胞[2]，并對細(xì)胞凋亡和/或壞死導(dǎo)致的細(xì)胞死亡進(jìn)行定量分析。

AF488 是明亮、光穩(wěn)定、親水性磺化羅丹明熒光團(tuán)。該染料在綠色 (FITC) 通道中發(fā)射。其最大吸收量最大發(fā)射波長為 495 nm。位于 519 nm。

碘化丙啶是一種膜不可滲透的 DNA 染色劑，可根據(jù)膜的完整性區(qū)分壞死細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和健康細(xì)胞。 DNA 結(jié)合后，染料在橙紅色通道中發(fā)射。其最大吸收量最大發(fā)射波長為 535 nm。位于 617 nm。

該細(xì)胞凋亡檢測試劑盒可進(jìn)行 50 次測試，包含使用 AF488 偶聯(lián)的膜聯(lián)蛋白 V 和碘化丙啶標(biāo)記凋亡和壞死細(xì)胞所需的所有試劑。

套件組件

建議的膜聯(lián)蛋白 V-AF488 最終濃度為 2 至 5 µg/mL，具體取決于所研究的細(xì)胞培養(yǎng)物。實(shí)驗(yàn)前需要對Annexin V-AF488的不同稀釋度進(jìn)行測試，以確定最佳濃度。

可選用碘化丙啶染色 。如果不需要檢查壞死情況，可以跳過此步驟。

重要的！膜聯(lián)蛋白 V 只能用作具有完整質(zhì)膜的細(xì)胞凋亡的標(biāo)志物。如果質(zhì)膜的完整性受到破壞，Annexin V 就會與細(xì)胞內(nèi)的 PS 結(jié)合并產(chǎn)生假陽性結(jié)果。

溶液的制備

1. 將膜聯(lián)蛋白 V-AF488 凍干結(jié)合物 (11172)管的內(nèi)容物溶解在 50 µL 去離子水中。 / 將膜聯(lián)蛋白 V-AF488 凍干結(jié)合物 (21172)管中的內(nèi)容物溶解在 250 µL 去離子水中。

   重要的！ 溶解的結(jié)合物應(yīng)避光保存在  2-8°C 下。  在溶液中，結(jié)合物可穩(wěn)定一個(gè)月。如需長期使用，建議分裝并保存在-20°C。避免再次凍結(jié)！

2. 將 1 份 5x 結(jié)合緩沖液與 4 份去離子水 混合，制備所需體積的 1x 結(jié)合 緩沖液。

細(xì)胞染色

1. 以合適的方式小心地從生長表面去除貼壁細(xì)胞。有了懸浮細(xì)胞，就從下一步開始工作。

2. 用冷 PBS (pH7.4) 洗滌細(xì)胞一次，并用 1x 結(jié)合緩沖液洗滌細(xì)胞一次。

3. 將細(xì)胞重懸于冷的 1x 結(jié)合緩沖液中。

4.  在 1.5 mL 微量離心管中收集 100 μL 細(xì)胞懸浮液（1×10 5至 1×10 6細(xì)胞/mL）。對于流式細(xì)胞術(shù)，有必要準(zhǔn)備帶有適當(dāng)對照的額外試管（參見下面的對照說明）。

5. 將 2-5 µL 的膜聯(lián)蛋白 V-AF488 溶液添加到每個(gè)管中，并在室溫下避光 孵育 

   10-15 分鐘。

6. 無需預(yù)先清洗，向每個(gè)管中添加 400 µL 1x 結(jié)合緩沖液。

7. （可選）向每個(gè)管中添加 5 µL 碘化丙啶。輕輕混合管中的內(nèi)容物，并在室溫下避光孵育 5 分鐘。

   重要的！不要清洗細(xì)胞以去除碘化丙啶。在數(shù)據(jù)收集期間，碘化丙啶必須保留在緩沖區(qū)中。

8. 染色的細(xì)胞應(yīng)保存在 

   2-8°C 的

    暗處直至分析。

   重要的！由于碘化丙啶對細(xì)胞活力的負(fù)面影響，必須在染色開始后 4 小時(shí)內(nèi)通過流式細(xì)胞術(shù)或熒光顯微鏡進(jìn)行定量分析。

流式細(xì)胞術(shù)

1. 對于細(xì)胞凋亡和壞死的細(xì)胞熒光分析，需要準(zhǔn)備以下對照：未染色的細(xì)胞（儀器設(shè)置的陰性對照）；僅用膜聯(lián)蛋白 V-AF488 染色的細(xì)胞，僅用碘化丙啶染色的細(xì)胞（以調(diào)整補(bǔ)償）。

2. 使用 FITC 發(fā)射信號檢測器分析膜聯(lián)蛋白 V-AF488 的結(jié)合。

3. 使用藻紅蛋白發(fā)射信號檢測器分析碘化丙啶染色。

熒光顯微鏡

1. 將一滴染色的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到載玻片上。用蓋玻片蓋住細(xì)胞。

2. 或者，貼壁細(xì)胞可以直接在蓋玻片上染色。染色后，將蓋玻片翻轉(zhuǎn)到載玻片上，將細(xì)胞放置在載玻片和蓋玻片之間。

3. （可選）用膜聯(lián)蛋白 V 染色后，可以用 1x 結(jié)合緩沖液洗滌細(xì)胞，并在成像前將細(xì)胞固定在 2% 多聚甲醛中。在與膜聯(lián)蛋白 V-AF488 一起孵育之前不要固定細(xì)胞，因?yàn)榧?xì)胞膜的任何破壞都可能導(dǎo)致膜聯(lián)蛋白 V 與細(xì)胞膜內(nèi)表面上的 PS 非特異性結(jié)合。

4. 使用熒光顯微鏡對細(xì)胞進(jìn)行成像，并使用 FITC 和羅丹明濾光片組。

染色結(jié)果

• 結(jié)合了膜聯(lián)蛋白 V-AF488 的早期凋亡細(xì)胞的質(zhì)膜呈綠色。

• 由于碘化丙啶滲透到細(xì)胞中，壞死細(xì)胞被染成紅色。

• 由于繼發(fā)性壞死而膜完整性受損的凋亡細(xì)胞被染成紅色（碘化丙啶），并在細(xì)胞表面（質(zhì)膜）上出現(xiàn)綠色暈圈（Annexin V-AF488）。

• 活細(xì)胞保持未染色。

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