免疫熒光（雙標）

免疫熒光（雙標）

 服務簡介：

在同一組織細胞標本上需要同時檢測兩種抗原時，需進行雙重熒光染色。雙重免疫熒光標記法(double immunofluorescence labeling method)也分為直接法和間接法。

冰凍切片熒光tunel+免疫熒光雙標實驗步驟

1、 冰凍切片固定：冰凍切片從冰箱拿出來復溫，晾干水分，冷丙酮固定10min，待丙酮*干后于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

2、 修復：切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止液體流走），在圈內(nèi)滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K儲存液用PBS 1:9稀釋）覆蓋組織，37度溫箱孵育30min。將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

3、 破膜：切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加破膜工作液覆蓋組織，常溫下孵育20min，將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

4、 加試劑1,2：按片子數(shù)量和組織大小取tunel試劑盒內(nèi)適量試劑1 (TdT) 和試劑2(dUTP)按2:29混合（試劑1,2為現(xiàn)配現(xiàn)用），加到圈內(nèi)覆蓋組織，切片平放于濕盒內(nèi)，37℃恒溫孵育2小時，濕盒內(nèi)加少量水保持濕度。

5、 BSA封閉:將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min，在圈內(nèi)滴加用3%BSA均勻覆蓋組織，室溫封閉30min。

6、 加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內(nèi)4°C孵育過夜。（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）

7、 加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應種屬的二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min。

8、 DAPI復染細胞核：切片用PBS（PH7.4）洗滌3次，每次5min。去除PBS后在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。

9、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

10、 鏡檢拍照：切片于尼康倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。（紫外激發(fā)波長330-380nm，發(fā)射波長420nm；FITC綠光激發(fā)波長465-495nm，發(fā)射波長515-555 nm；CY3紅光激發(fā)波長510-560，發(fā)射波長590nm）

石蠟切片熒光tunel+免疫熒光雙標實驗步驟

1、 石蠟切片脫蠟至水

2、 修復：切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止液體流走），在圈內(nèi)滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K儲存液用PBS 1:9稀釋）覆蓋組織，37度溫箱孵育30min。將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

3、 破膜：切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加破膜工作液覆蓋組織，常溫下孵育20min，將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

4、 加試劑1,2：按片子數(shù)量和組織大小取tunel試劑盒內(nèi)適量試劑1 (TdT) 和試劑2(dUTP)按2:29混合，加到圈內(nèi)覆蓋組織，切片平放于濕盒內(nèi)，37℃恒溫箱孵育2小時，濕盒內(nèi)加少量水保持濕度。

5、 BSA封閉:將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min，在圈內(nèi)滴加用3%BSA均勻覆蓋組織，室溫封閉30min。

6、 加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內(nèi)4°C孵育過夜。（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）

7、 加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應種屬的二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min。

8、 DAPI復染細胞核：切片用PBS（PH7.4）洗滌3次，每次5min。去除PBS后在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。

9、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

10、 鏡檢拍照：切片于尼康倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。（紫外激發(fā)波長330-380nm，發(fā)射波長420nm；FITC綠光激發(fā)波長465-495nm，發(fā)射波長515-555 nm；CY3紅光激發(fā)波長510-560，發(fā)射波長590nm）

 上海茁彩生物科技有限公司,可以承接諸多病理實驗，樣本不僅含有基礎的動物組織切片，還包括植物葉片、動物細胞、骨片、腦片、皮膚等特殊樣本。染色種類多，染色方法全.石蠟染色，冰切染色均可操作,同時還可以承接整體實驗項目,細胞實驗項目,包括樣本的造模,細胞的培養(yǎng),以及后續(xù)細胞的增殖、細胞粘附、細胞劃痕等實驗.