石蠟切片免疫組化

實(shí)驗(yàn)步驟

1、 石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-無(wú)水乙醇Ⅰ5min-無(wú)水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-蒸餾水洗。

2、 抗原修復(fù)：組織切片置于盛滿EDTA抗原修復(fù)緩沖液（PH9.0）的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)，中火8min至沸，?；?min保溫再轉(zhuǎn)中低火7min，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā)，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。

3、 阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：切片放入3%過氧化氫溶液（雙氧水：純水=1:9），室溫避光孵育25 min，將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。

4、 BSA或者血清封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止抗體流走），在圈內(nèi)滴加用3%BSA或者10%正常兔血清均勻覆蓋組織，室溫封閉30min。（一抗是山羊來(lái)源用10%正常兔血清封閉，一抗其它來(lái)源的用3%BSA封閉）

5、 加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內(nèi)4°C孵育過夜。（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）

6、 加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的二抗（HRP標(biāo)記）覆蓋組織，室溫孵育50min。

7、 DAB顯色：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時(shí)間，陽(yáng)性為棕黃色，自來(lái)水沖洗切片終止顯色。

8、 復(fù)染細(xì)胞核：Harris蘇木素復(fù)染3min左右，自來(lái)水洗，1%的鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來(lái)水沖洗，氨水返藍(lán)，流水沖洗。

9、 脫水封片：將切片依次放入75%酒精6min-85%酒精6min --無(wú)水乙醇Ⅰ6min -無(wú)水乙醇Ⅱ6min -二甲苯Ⅰ5min 中脫水透明，將切片從二甲苯拿出來(lái)稍晾干，中性樹膠封片。

10、 顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

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