WB（普通蛋白），通過電泳區(qū)分不同的蛋白組分，并轉(zhuǎn)移至固相支持物（膜），通過特異性試劑（抗體）作為探針，對靶物質(zhì)進(jìn)行檢測。可檢測到低至1～5ng（低可到10～100pg）中等大小的靶蛋白。

WB（普通蛋白）

服務(wù)簡介：

通過電泳區(qū)分不同的蛋白組分，并轉(zhuǎn)移至固相支持物（膜），通過特異性試劑（抗體）作為探針，對靶物質(zhì)進(jìn)行檢測?？蓹z測到低至1～5ng（低可到10～100pg）中等大小的靶蛋白。
 

服務(wù)說明

Western Blot實驗步驟

1、 細(xì)胞總蛋白提取

1.1 對于懸浮細(xì)胞: 離心收集細(xì)胞，每106細(xì)胞加250 ul  RIPA（在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑），振蕩。如果需要提高蛋白濃度，可以適當(dāng)減少細(xì)胞總蛋白提取試劑體積。

1.2 對于貼壁細(xì)胞:

1.2.1 用TBS沖洗細(xì)胞2-3次。后一次*吸干殘留液。

1.2.2 加入適當(dāng)體積的 RIPA（使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑）于培養(yǎng)板、瓶內(nèi)3-5min。期間反復(fù)晃動培養(yǎng)板、瓶，使試劑與細(xì)胞充分接觸。

1.2.3 用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞及試劑刮下，收集到1.5ml離心管中。

1.3 冰浴30min，期間用移液器反復(fù)吹打，確保細(xì)胞*裂解。

1.4 12000g離心5min，收集上清，即為總蛋白溶液。

2、 組織蛋白提取：

2.1 組織塊用冷TBS洗滌2-3次，去除血污，剪成小塊置于勻漿器。加入10倍組織體積本試劑（使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑）冰上*勻漿。如果需要提高蛋白濃度，可以適量減少該試劑體積。

2.2 將勻漿液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，振蕩。冰浴30min，期間用移液器反復(fù)吹打，確保細(xì)胞*裂解。

2.3 12000g離心5min，收集上清，即為總蛋白溶液。

3、 蛋白濃度測定：BCA法側(cè)蛋白濃度

4、 SDS-PAGE電泳

4.1 清洗玻璃板

4.2 灌膠與上樣

4.2.1 將玻璃板對齊后放入夾中卡緊，操作時要使兩玻璃對齊，以免漏膠。

4.2.2 按實驗安排配制分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。大約45min后可倒去膠上層水并用吸水紙將剩余水吸干。

                                    分離膠配比

 

	分離膠濃度
試劑	8%	10%	12%	15%	18%	20%	8%	10%	12%	15%	18%	20%
H2O   ml	4.63	4	3.3	2.3	1.3	0.63	6.9	5.9	4.9	3.4	1.9	0.9
30％丙烯酰胺（29：1） ml	2.67	3.3	4	5	6	6.67	4	5	6	7.5	9	10
1.5M TRIS－Hcl(PH 8.8) ml	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	3.8	3.8	3.8	3.8	3.8	3.8
10％SDS ml	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.15	0.15	0.15	0.15	0.15	0.15
AP  ml	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.15	0.15	0.15	0.15	0.15	0.15
TEMED  ul	5ul	5ul	5ul	5ul	5ul	5ul	7.5ul	7.5ul	7.5ul	7.5ul	7.5ul	7.5ul
總體積 ml	10ml						15ml

 

 

              5%濃縮膠配比

試劑	濃度   5%
H2O ml	2	3	4	6
30％丙烯酰胺（29：1）ml	0.5	0.75	1	1.5
1M  TRIS－Hcl(PH 6.8)ml	0.5	0.75	1	1.5
10％SDS ul	40	60	80	120
AP  ul	30	45	60	90
TEMED  ul	4ul	6ul	8ul	12ul
總體積 ml	3ml	4.5ml	6ml	9ml

 

4.2.3 按前面方法配5%的濃縮膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。

4.3 加足夠的電泳液后上樣電泳。將樣品加入電泳孔中，電泳。濃縮膠電壓75V，分離膠用120V。電泳至溴酚藍(lán)剛跑出即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。

5 轉(zhuǎn)膜  （小于20kd的蛋白請使用0.22um的PVDF膜。）

5.1 準(zhǔn)備6張7×9cm的濾紙和一張大小適中的 PVDF膜，PVDF膜在使用之前要先用甲醇活化。

5.2 在加有轉(zhuǎn)移液的盆里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子，兩塊海綿墊，一支玻棒，濾紙和經(jīng)過活化的PVDF膜。

5.3 將夾子打開使黑的一面保持水平。在墊子上墊海綿、三層濾紙。

5.4 小心剝下分離膠蓋于濾紙上，將膜蓋于膠上，并除氣泡。在膜上蓋三張濾紙并除去氣泡。后蓋上另一個海綿墊。

5.5 轉(zhuǎn)膜條件（濕轉(zhuǎn)）

5.5.1 快轉(zhuǎn)。300mA恒流轉(zhuǎn)膜半小時，或者200mA轉(zhuǎn)膜1小時，時間可以略微調(diào)整，時間對應(yīng)調(diào)整。

5.5.2 慢轉(zhuǎn)。轉(zhuǎn)膜過夜，25V恒壓轉(zhuǎn)膜過夜。

6 免疫反應(yīng)

6.1 將轉(zhuǎn)好的膜于室溫下脫色搖床上用5%的脫脂牛奶(0.5%TBST配)，封閉1h。

6.2 稀釋一抗（TBST溶解的5%脫脂牛奶，磷酸化蛋白使用TBST溶解的5%BSA），4℃孵育過夜（快轉(zhuǎn)），或者4℃孵育抗體3小時（慢轉(zhuǎn)）。

6.3 用TBST在室溫下脫色搖床上洗三次，每次5min

6.4 將二抗用TBST稀釋3000倍，室溫下孵育30min后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗三次，每次5min

7 化學(xué)發(fā)光 將ECLA和ECLB兩種試劑在離心管中等體積混合，將PVDF膜的蛋白面朝上與此混合液充分接觸，1-2min后，去盡殘液，包好，放入暗匣中曝光。后用顯影、定影試劑進(jìn)行顯影和定影。根據(jù)不同的光強(qiáng)度調(diào)整曝光條件。

8 凝膠圖像分析 將膠片進(jìn)行掃描存檔，PhotoShop整理去色，Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。

 

注意事項

 

蛋白樣品制備的注意事項：

1、細(xì)胞數(shù)量達(dá)5×106

2、將細(xì)胞裂解液再離心，收集上清液，加loading煮樣5min。

SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳注意事項：

1、做膠：防止漏膠、進(jìn)氣泡以及花膠（水封、插梳子和拔梳子）

2、加樣：兩邊加loading，加樣量一樣，加樣時間要盡量短，以免樣品擴(kuò)散。

3、電泳：將膠夾好放于電泳槽中，加電泳buffer（內(nèi)外面不能聯(lián)通），將電壓調(diào)到90V開始電泳。

轉(zhuǎn)膜注意事項：

1、泡膜：轉(zhuǎn)膜之前將海綿、膠、膜都用預(yù)冷的轉(zhuǎn)移buffer浸泡20min。（1.凝膠若是沒在預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜buffer中浸泡，就會在轉(zhuǎn)膜過程中出現(xiàn)凝膠皺縮，導(dǎo)致出現(xiàn)轉(zhuǎn)移條帶變形。2.PVDF膜具有疏水性，需用甲醇浸泡）

2、轉(zhuǎn)膜順序：陰極碳板+海綿+三濾+膠+膜+三濾+海綿+陽極碳板

3、轉(zhuǎn)膜條件：0.35A 250V 1h40min 冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜（具體轉(zhuǎn)膜時間要根據(jù)目的蛋白的大小而定；目的蛋白的分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時間越長，反之則短）

4、避免直接用手碰雜交膜，使用鑷子。因為手上的蛋白和油脂會影響轉(zhuǎn)膜效率并會使膜臟掉。

5、夾好膜和凝膠后，確定在凝膠/膜和濾紙之間沒有氣泡存在，否則會導(dǎo)致轉(zhuǎn)膜不*。

6、保證膜和濾紙的大小和凝膠*一樣，過大和過小都會影響轉(zhuǎn)膜效率。

7、雞來源的抗體與PVDF和尼龍膜有較強(qiáng)的結(jié)合能力，從而產(chǎn)生較高的背景，故如果選擇雞來源的抗體使用硝酸纖維素膜（NC膜）

關(guān)于磷酸化蛋白檢測的注意事項：

1、保持待測蛋白處于磷酸化狀態(tài)！在標(biāo)本提取液中加入足夠的磷酸酶抑制劑（NaF，可以防止去磷酸化），并將標(biāo)本時刻保持在冰浴中！

2、使用5%的BSA作為封閉試劑！不能使用脫脂奶粉?。ㄒ驗槊撝谭壑泻欣业鞍?，會出現(xiàn)很高的背景）。

抗體保存注意事項：

1、收到抗體后按要求離心后再打開管蓋進(jìn)行分裝盒保存！

2、對于大部分抗體，比較合適的保存方式是分裝后保存在-20℃

  2.1 分裝的量以一次實驗用完為好，少不能少于10μl每份。因為分裝體積越小，抗體的濃度越可能會受到蒸發(fā)以及管壁吸附的影響。

  2.2 復(fù)融后的分裝抗體如果一次用不完，將剩余母液保存在4℃，避免再凍起來！

  2.3 避免將抗體保存在自動除霜冰箱中。

3、大部分抗體收到后4℃短暫保存1-2周對抗體活性是沒有影響的。

4、長期保存，加入疊氮鈉，防止細(xì)菌污染。

WB（普通蛋白）