技術(shù)文章
慢腺病毒細(xì)胞株構(gòu)建研實驗技術(shù)服務(wù)介紹
閱讀:32 發(fā)布時間:2024-9-19
技術(shù)原理
慢病毒包裝:使用3質(zhì)粒慢病毒包裝系統(tǒng),慢病毒系統(tǒng)使用pLKO.1-EGFP、psPAX2、pMD2.G,過表達慢病毒系統(tǒng)使用pLVX-AcGFP、psPAX2、pMD2.G三質(zhì)粒系統(tǒng),將質(zhì)?;靹蚝笫褂昧姿徕}轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中,培養(yǎng)48h后,收集上清。純化后留取部分檢測病毒滴度,其余病毒凍存于-80℃冰箱中。
滴度檢測:將病毒顆粒使用梯度稀釋,分別感染293T細(xì)胞,感染72h后,在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光表達情況。根據(jù)細(xì)胞熒光量計算病毒滴度。
細(xì)胞感染:在病毒感染前一天對細(xì)胞進行計數(shù),接種約10000個細(xì)胞于12孔板中,培養(yǎng)過夜后使用無血清培養(yǎng)基稀釋病毒,加入12孔板中對細(xì)胞進行感染,病毒數(shù)量根據(jù)推薦細(xì)胞的感染MOI加入(若無推薦MOI,需做病毒梯度:1,5,10,50,1005個梯度對細(xì)胞感染),感染6h后去除含病毒溶液,加入wan全培養(yǎng)基細(xì)胞培養(yǎng),培養(yǎng)48h后,在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光強度。同時加入puromycin對細(xì)胞篩選,篩選約2周時間。細(xì)胞篩選好后,使用定量PCR和Westernblot檢測目的基因的穩(wěn)定表達情況。
實驗方法
1、MOI(multiplicityofinfectin),感染復(fù)數(shù),含義為感染時病毒和細(xì)胞數(shù)量的比值。多數(shù)細(xì)胞查閱文獻也能獲得推薦的MOI,但不同實驗室,不同病毒測算出的MOI也有差別。所以建議根據(jù)自己包裝的慢病毒重新檢測MOI。
2、為了能獲得最佳效果的單克隆穩(wěn)定細(xì)胞株,可以增大篩選的總量。