酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法通常用于評估抗原特異的T細(xì)胞的功效，即檢測IFN-γ的釋放。酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法是一種非常靈敏的免疫檢測方法，它可以在單細(xì)胞水平檢測細(xì)胞因子的分泌。酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法是靈敏的細(xì)胞檢測方法之一，它檢測的靈敏度可以達(dá)到1：100 000個細(xì)胞。依賴于化學(xué)物質(zhì)的分析，酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)分析可以比傳統(tǒng)的ELISA靈敏20到200倍。
一、材料和試劑
1. ELISpotKits
（1）Mouse IFN-γ ELISpotkit（ALP）（Mabtech 3321-2A）
（2）Human IFN-γ ELISpotkit（ALP）（Mabtech 3420-2A）
注釋：以上的ELISpotKits可用性已經(jīng)經(jīng)過作者測試，用戶也可以用按自己的需要換別的替代。
2. 其它材料
（1）SIGMAFASTTM BCIP/NBT（Sigma B5655）
（2）1×Phosphate Buffered Saline（PBS）
（3）Wash Buffer：1×PBS，0.1%Tween-20（Santa cruz biotechnology，sc-29113）
（4）Phorbol 12-myristate13-acetate（PMA）（Sigma 79346）
（5）鈣離子載體Ionomycin（SigmaI 9657）
二、設(shè)備
1. biosys Bioreader 7000
三、步驟
1. 天：準(zhǔn)備ELISpot板（無菌環(huán)境）
（1）用無菌的PBS，pH7.4，稀釋包被抗體（AN18）（16 μl 抗體稀釋在8 ml PBS，1：500）。
（2）把ELISpot板從包裝里拿出來，每個孔加75 μl 抗體溶液，4-8℃過夜孵育。
2. 第二天：在板上孵育細(xì)胞（無菌環(huán)境）
（1）倒掉過多的抗體，用無菌的WashBuffer（PBS-T）洗板5次，每個孔250 μl。
（2）每個孔加250 μl 的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中包含與用于懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)液相同的10%的血清（通常是FBS），置于室溫孵育至少2個小時。
（3）倒掉培養(yǎng)基，并加入含有誘導(dǎo)物的細(xì)胞懸浮液。
一般要做如下幾組：不含誘導(dǎo)物的細(xì)胞、混有抗原（蛋白或多肽）的細(xì)胞和含PMA（10 ng/ml）和鈣離子載體Ionomycin（500 ng/ml）的細(xì)胞（陽性對照）。每個孔中的細(xì)胞數(shù)目決定于你的樣品中IFN釋放細(xì)胞的比例，通常是從2×104到2.5×105。如果靶細(xì)胞是多肽脈沖T2（T2pulsedwithpeptide）或瘤細(xì)胞，那么T細(xì)胞/靶細(xì)胞的比例需要滿足達(dá)到佳的檢測效果。
（4）把板置于37℃濕潤的培養(yǎng)箱，CO2的濃度為5%，培養(yǎng)12-48小時。在這期間不要挪動板，并設(shè)法避免蒸發(fā)。
3. 第三天：在板上孵育細(xì)胞（無菌環(huán)境）
（1）倒空板上的細(xì)胞，每個孔加250 μl 的水，保持在冰上10分鐘。
（2）用Wash Buffer洗板5次，每個孔250 μl。
（3）稀釋檢測抗體（R4-6A2-biotin）至濃度為0.5-1 μg/ml（4 μl 抗體稀釋在8 ml PBS，1：2 000）。用加有0.5%FBS的PBS稀釋。每個孔加75 μl，37℃下孵育2個小時。
（4）用Wash Buffer洗板5次，每個孔250 μl。
（5）用PBS-0.5%FBS稀釋Streptavidin-ALP（1：1 000），每個孔加100 μl，室溫孵育1個小時。
（6）用Wash Buffer洗板5次，每個孔250 μl。
（7）在10 ml ddH2O中溶解一片BCIP/NBT即配成底物溶液，每個孔加100 μl。
（8）把板放在黑暗中反應(yīng)，直到有清楚的斑點(diǎn)顯示出來。
（9）用大量的自來水清洗終止顏色反應(yīng)。如果有必要，把板從盤里取出來漂洗干凈底下的膜。
（10）晾干板，用biosys Bioreader 7000或在解剖鏡下（不推薦）檢測并統(tǒng)計(jì)斑點(diǎn)數(shù)。
（11）板在避光的條件下室溫保存。
ELISpot檢測INF-γ 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)
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