核酸藥物遞送系統(tǒng)——脂質(zhì)納米顆粒（LNP）

脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）的主要作用是攜帶和傳遞遺傳信息。這兩類分子能夠用于疾病的預(yù)防、診斷和zhi療的，就是核酸藥物。核酸藥物包括反義核酸（ASO）、小干擾RNA（siRNA）、微小RNA（miRNA）、小ji活RNA（saRNA）、信使RNA（mRNA）適配體（aptamer）、核酶(ribozyme)、抗體核酸偶聯(lián)藥物（ARC）等，是基因zhi療的一種形式。核酸藥物的優(yōu)點(diǎn)是可以簡單地通過重新排列A，G，C，T（U）的序列而成為新的藥物。核酸藥物能夠以化學(xué)藥物或抗體藥物無法靶向（例如mRNA和miRNA）的分子作為作用靶點(diǎn)，有望對傳統(tǒng)藥物療效不佳的疾病產(chǎn)生突破性的進(jìn)展，比如難以zhi療的遺傳疾病、ai癥以及某些病毒感（例如SARS-CoV-2）。近期FDA宣布新指南鼓勵基因zhi療（包括核酸藥物）創(chuàng)新。諾華、默沙東、輝瑞制藥、藥明康德等多家藥企在該領(lǐng)域進(jìn)行了重要的布局。

由于疫，mRNA疫苗、核酸藥物等獲得了更多的關(guān)注。現(xiàn)在mRNA疫苗、核酸藥物多是采用脂質(zhì)納米顆粒（LNP）來實(shí)現(xiàn)對mRNA等核酸分子的遞送的，輝瑞、Moderna等上市的mRNA疫苗以及早的RNA類藥物onpattro都是采用了脂質(zhì)納米顆粒來遞送各自的核酸藥物。本文綜述了脂質(zhì)納米顆粒在核酸藥物遞送的作用，組成，關(guān)鍵輔料，制備工藝等方面。

1.核酸藥物傳遞系統(tǒng)是關(guān)鍵

核酸藥物的開發(fā)主要面臨三大問題：

1.1.核酸分子在體內(nèi)不穩(wěn)定性；

1.2.核酸分子潛在的副作用；

1.3.核酸藥物遞送系統(tǒng)開發(fā)難度大。

這其中重要的是遞送系統(tǒng)的研發(fā)。核酸藥物在其注射進(jìn)入人體后，如何存留足夠時間以準(zhǔn)確靶向到病變部位，同時避免損傷正常細(xì)胞，必須是研發(fā)出高效安全的藥物遞送系統(tǒng)，以解決核酸藥物遞送、穩(wěn)定性、脫靶效應(yīng)等難題。遞送系統(tǒng)可分為病毒載體和非病毒載體，病毒載體在基因zhi療中應(yīng)用較多，但由于其免疫原性、致瘤性、和有限的載藥量（loading capacity）使得其在核酸藥物中應(yīng)用相對較少；而非病毒載體應(yīng)用相對更多，如聚合物類（polymer）、脂質(zhì)類（liposome或LNP）；且可以將核酸藥物與特定的配體結(jié)合使其能夠靶向特定的細(xì)胞，如GalNAc、多肽、抗體等。LNP是目前核酸藥物研究應(yīng)用多的遞送系統(tǒng)之一，LNP能夠安全而有效地遞送核酸。目前已經(jīng)有使用LNP的核酸藥物獲批，例如Alnylam公司獲批的siRNA藥物Onpattro。LNP是目前比較成熟的一個技術(shù)平臺，用來遞送RNA藥物、疫苗或基因編輯工具。相對其他類型的核酸藥物遞送系統(tǒng)而言，LNP具有很多優(yōu)勢，比如核酸包封率高并且能夠有效轉(zhuǎn)染細(xì)胞，組織穿透性強(qiáng)，細(xì)胞毒性和免疫原性低，更有利于遞送藥物等優(yōu)勢，這些優(yōu)勢使LNP成為出色的核酸遞送系統(tǒng)。

2.核酸遞送脂質(zhì)納米顆粒（LNP）的組成

有一些公司在核酸遞送系統(tǒng)的脂質(zhì)配比上是非常相似的，LNP的方中可離子化陽離子脂質(zhì)占50%，剩下10%是中性脂質(zhì)，38-40%是膽固醇。脂質(zhì)納米顆粒（LNP）模擬細(xì)胞膜形成細(xì)胞，直徑只有100納米左右，成分包括中性脂質(zhì)、陽離子脂質(zhì)、膽固醇、PEG-脂質(zhì)。核酸藥物與普通化學(xué)藥物的明顯區(qū)別是核酸有數(shù)量龐大的磷酸根，因而呈負(fù)電，使用可離子化陽離子脂質(zhì)的LNP可以更好的包裹核酸藥物。陽離子脂質(zhì)有一個帶銨根的親水端，在酸性下與氫離子結(jié)合呈正電，借助兩者的靜電吸附，就能夠?qū)⒑怂岚谥|(zhì)納米粒中。當(dāng)LNP被細(xì)胞內(nèi)吞后，可離子化陽離子脂質(zhì)會在酸性環(huán)境下離子化，破壞內(nèi)涵體膜，從而實(shí)現(xiàn)LNP的內(nèi)涵體逃逸。LNP還可以設(shè)計(jì)成特異性結(jié)合載脂蛋白如APOE3，APOE3會將LNP帶到肝臟，LNP和肝細(xì)胞表面受體結(jié)合后通過細(xì)胞內(nèi)吞作用釋放藥物，起到靶向肝細(xì)胞的目的，包裹后的LNP外殼因陽離子脂質(zhì)的疏水端向外而呈疏水性，此時可以加入傳統(tǒng)脂質(zhì)體合成中常用的一端修飾有PEG的脂質(zhì)——PEG-脂質(zhì)，使PEG-脂質(zhì)的疏水端與陽離子脂質(zhì)的疏水端結(jié)合，而PEG-脂質(zhì)的親水端（連有PEG）則向外形成核酸脂質(zhì)納米粒的外殼。為了增加核酸脂質(zhì)納米粒的穩(wěn)定性，還可以添加適量的膽固醇等成分，使PEG-脂質(zhì)的疏水端與陽離子脂質(zhì)的疏水端結(jié)合更為緊密，得到核酸脂質(zhì)納米粒的成品。

3.核酸遞送脂質(zhì)納米顆粒（LNP）的關(guān)鍵輔料

核酸遞送脂質(zhì)納米顆粒一般由以下輔料組成：

3.1.陽離子脂質(zhì)：與帶負(fù)電的 mRNA 結(jié)合，可高效包載核酸藥物，同時提供正電荷，與帶負(fù)電荷的mRNA復(fù)合，有助于內(nèi)涵體逃逸，mRNA體內(nèi)轉(zhuǎn)染，可離子化脂質(zhì)具有pH敏感性。具體產(chǎn)品有DOTAP,Cl，DLin-MC3-DMA，DC-CHOL等。

3.2.膽固醇：穩(wěn)定LNP結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)膜流動性，提高粒子穩(wěn)定性。

3.3.輔助型脂質(zhì)：常用DOPE，穩(wěn)定粒子，破壞內(nèi)涵體穩(wěn)定性，提高核酸遞送效率。

3.4.聚乙二醇化磷脂：提高粒子穩(wěn)定性，減少粒子在體內(nèi)與血漿蛋白的結(jié)合，延長體循環(huán)時間。例如DMG-PEG2000，DSPE-MPEG2000（藥用注射級）等。

3.5.穩(wěn)定劑蔗糖或海藻糖，提高LNP和mRNA疫苗的穩(wěn)定性，防止脂質(zhì)黏性過大。

4. 核酸遞送脂質(zhì)納米顆粒（LNP）的氮磷比計(jì)算

在核酸脂質(zhì)納米顆粒合成時，正電荷與負(fù)電荷的數(shù)量比將影響到納米粒子的穩(wěn)定性、電位等性能。正電荷通常為具有可電離銨根（N）的陽離子脂質(zhì)，而負(fù)電荷則為帶有大量磷酸根（P）的核酸分子，兩者可通過靜電吸附的方式結(jié)合在一起。兩者不合理的比例可能會導(dǎo)致粒徑過大、穩(wěn)定性差等缺陷，正確計(jì)算正電荷與負(fù)電荷的比（N/P比）是非常重要的。在實(shí)際應(yīng)用中，也可以先定下N/P比，再確定有機(jī)相或水相的濃度，此時只需要逆向計(jì)算即可。

5. 核酸遞送脂質(zhì)納米顆粒（LNP）的制備

目前常用的脂質(zhì)納米顆粒制備方法主要有薄膜水化法、擠出法、均質(zhì)法等。有報道采用微流控混合技術(shù)來制備核酸脂質(zhì)納米顆粒，該方法相對簡便快速，條件溫和，同時容易實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)放大。通過不同生產(chǎn)規(guī)模的微流控機(jī)器，可以較好的實(shí)現(xiàn)mRNA-LNP的良好制備，其結(jié)果一致性良好，粒徑結(jié)果合適，且具有極低的PDI值，證實(shí)其分散性較好，并且包封效果可達(dá)90%以上。通過微流控技術(shù)高效、可放大的制備核酸脂質(zhì)納米粒，每小時可生產(chǎn)20升。

微流控技術(shù)基本原理：將脂質(zhì)與核酸分別溶解在水相和有機(jī)相后，將兩相溶液注入制備系統(tǒng)的兩條入口通道，一端是RNA的水溶液，一端是脂質(zhì)的乙醇溶液，通過兩相的快速混合，完成核酸脂質(zhì)納米顆粒的合成。 改變流體注入速度和比率，可以控制脂質(zhì)納米顆粒的粒徑大小。

也有文獻(xiàn)報道采用類似于微流控技術(shù)的沖擊式射流混合法可以實(shí)現(xiàn)大生產(chǎn)，利用 BlueShadow 80P 高壓泵，讓疫苗和脂質(zhì)溶液形成兩股射流，在腔體中進(jìn)行對沖，利用流體動力學(xué)讓脂質(zhì)各個組分充分地混合，形成包裹mRNA的納米脂質(zhì)體顆粒。生產(chǎn)設(shè)備碰撞噴射混合器安裝在潔凈間（C級）內(nèi)，通過中控平臺控制工藝步驟中所有單元的流量。所有單元安裝在不銹鋼框架內(nèi)，以適應(yīng)藥品生產(chǎn)中的 CIP清潔程序。該系統(tǒng)包括：KNAUER 碰撞噴射混合器（IJM)， 脂質(zhì)/乙醇混合物和 mRNA/緩沖液混合物的入口管路，脂質(zhì)體出口管路，CIP在線清潔系統(tǒng)和不銹鋼框架。

6. 核酸遞送脂質(zhì)納米顆粒（LNP）的專li

mRNA核酸技術(shù)起源于20多年前，主要來自UBC和UPenn。后面發(fā)現(xiàn)LNP可以很好的解決mRNA成藥，所以針對LNP專li產(chǎn)生了很多的授權(quán)。在陽離子LNP的專li上，一般小核酸領(lǐng)域的企業(yè)的專li布局結(jié)構(gòu)為：由母案保護(hù)重要的脂質(zhì)制劑活性成分，分案保護(hù)脂質(zhì)制劑和zhi療性siRNA的組合，同時由于美國申請存在期限調(diào)整的制度，大廠會利用多重專li申請?jiān)谝欢ǔ潭壬汐@取不同的延長期限以延長專li對于產(chǎn)品的保護(hù)期。因此，在Arbutus前身Tekmira對于MC3脂質(zhì)體專li進(jìn)行了詳盡保護(hù)的前提下，除非對于陽離子脂質(zhì)設(shè)計(jì)進(jìn)行極大變革，很難突破陽離子脂質(zhì)體專li壁壘。但可以通過替換 LNP 中的其他脂質(zhì)，規(guī)避陽離子脂質(zhì)的專li壁壘，例如麗凡達(dá)生物用陰離子脂質(zhì)DOPS 替代了 輝瑞和 Moderna 方中的中性脂質(zhì) DSPC。

目前國內(nèi)也發(fā)布了一種新型陽離子脂質(zhì)體專liCN201310099727.5，該專li包含陽離子脂質(zhì)體核酸類藥物制劑及其制備方法和用途。陽離子脂質(zhì)體方主要包含陽離子脂質(zhì)，輔助磷脂，聚羧基甜菜堿脂質(zhì)分子和冷凍保護(hù)劑。該專li涉及的陽離子脂質(zhì)體克服了陽離子脂質(zhì)體毒性高，血液穩(wěn)定性差和轉(zhuǎn)染效率低的缺點(diǎn)，有效地提高了核酸類藥物的藥效，同時由于該制劑使用時不受血清干擾，因此簡化了實(shí)驗(yàn)和zhi療中操作。

7.核酸遞送脂質(zhì)納米顆粒國內(nèi)發(fā)展的問題

對于核酸藥物，LNP與其他遞送系統(tǒng)相比，其包封效果、體內(nèi)外表達(dá)效果、體內(nèi)安全性等多方面都更具優(yōu)勢，可以說脂質(zhì)納米顆粒（LNP）是佳的遞送系統(tǒng)。國內(nèi)已有多家企業(yè)，例如瑞博生物，艾博生物，斯微生物，麗凡達(dá)生物， 圣諾生物等均投資研發(fā)核酸藥物脂質(zhì)納米顆粒遞送系統(tǒng)關(guān)鍵技術(shù)。據(jù)報道2020年廣州銳博生物技術(shù)有限公司投資1016萬元，建設(shè)核酸藥物脂質(zhì)納米顆粒遞送系統(tǒng)關(guān)鍵技術(shù)研究平臺，開展核酸藥物體內(nèi)遞送系統(tǒng)關(guān)鍵技術(shù)開發(fā)。

但有三大難題依然制約國內(nèi)脂質(zhì)納米顆粒技術(shù)的發(fā)展：

1.輔料的缺乏，脂質(zhì)納米顆粒輔料的研發(fā)，輔料國產(chǎn)化；

2. 缺乏成熟的工業(yè)化生產(chǎn)設(shè)備；

3.缺乏既懂得制劑學(xué)和高分子材料學(xué)，又懂得制藥工程設(shè)備的人才；

如上所述，脂質(zhì)納米顆粒LNP作為非常有前景的核酸藥物載體，在制藥行業(yè)已備受關(guān)注。特別是現(xiàn)在，LNP是mRNA疫苗的關(guān)鍵技術(shù)，在有效保護(hù)mRNA并將其運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞當(dāng)中發(fā)揮著舉足輕重的作用。同時LNP也應(yīng)用擴(kuò)展到其他領(lǐng)域，比如醫(yī)學(xué)影像、化妝品、營養(yǎng)品、農(nóng)業(yè)以及納米反應(yīng)器等。隨著新輔料的發(fā)現(xiàn)，制備工藝的創(chuàng)新改進(jìn)，LNP會表現(xiàn)出更復(fù)雜的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和更優(yōu)的物理穩(wěn)定性，未來將會看到更多基于LNP遞送的核酸藥物上市，為腫liu等多種疾病提供zhi療方案。

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