凡人修煉脂質(zhì)體秘籍5----制備工藝篇

前面幾篇已對脂質(zhì)體的文獻查閱，處方輔料等做了大量的描述，本篇對脂質(zhì)體的制備工藝做專門的介紹。藥物包封率、無菌性、藥物保留性、制備方法和可否規(guī)?；a(chǎn)，脂質(zhì)體穩(wěn)定性和成本及有效性都取決于脂質(zhì)體中載藥方法的選擇。脂質(zhì)體制備工藝的區(qū)別在于脂質(zhì)從有機溶劑中干燥或分離然后再分散在水性介質(zhì)中的方式。脂質(zhì)體的主要制備工藝可分為主動載藥法和被動載藥法兩種。被動載藥法包括薄膜分散法、逆向蒸發(fā)法、二次乳化法、溶劑注入法、冷凍干燥法、熔融法去污劑除去法等。主動載藥法包括PH值梯度法、硫酸銨梯度法、醋酸鈣梯度法、離子載體法等。

1. *發(fā)布的指南文章對脂質(zhì)體工藝要求

1.1國外有2015年 FDA Liposome Drug Products脂質(zhì)體藥物制藥工業(yè)指南草案。

建議附上詳細的工藝流程圖和各操作點工藝監(jiān)控參數(shù)變化范圍及過程控制的描述。這些變化范圍應基于藥學開發(fā)的研究結(jié)果。

1.2國內(nèi)在 2020-11-30 頒布了鹽酸多柔比星脂質(zhì)體注射液仿制藥研究技術(shù)指導原則（試行）。

采用硫酸銨梯度法制備的主要步驟包括：1）空白脂質(zhì)體的制備，2）硫酸銨梯度的形成，3）活性藥物的裝載?；钚运幬锏难b載是多柔比星在脂質(zhì)體內(nèi)外相的硫酸銨濃度梯度驅(qū)動下擴散到空白脂質(zhì)體內(nèi)完成的。應提供詳細的生產(chǎn)工藝開發(fā)研究資料和工藝驗證資料（包括無菌工藝驗證資料）。建議制定合理的生產(chǎn)過程控制策略，如關(guān)鍵步驟的生產(chǎn)時限、關(guān)鍵中間體的質(zhì)量控制標準和保持時限等。應特別關(guān)注生產(chǎn)工藝和批量對產(chǎn)品質(zhì)量可控性的影響，注冊批和商業(yè)批的生產(chǎn)工藝及批量原則上應保持一致。

1.3中國藥審中心：2005年10月20日細胞毒類抗腫瘤藥脂質(zhì)體制劑專題會會議紀要 。

目前報道的制備方法(如高壓乳勻過濾法、注入法、旋轉(zhuǎn)成膜水化法)均有工藝放大的可行性，但在研究的初期，就需關(guān)注工業(yè)化大生產(chǎn)需配套的儀器設備以及關(guān)鍵工藝環(huán)節(jié)的研究。根據(jù)目前的研究經(jīng)驗，對于旋轉(zhuǎn)成膜水化后的產(chǎn)品，一般都不是很均勻，都需要經(jīng)過勻質(zhì)化處理（如超聲，高壓乳勻）。 

1.4中國藥審中心關(guān)于脂質(zhì)體、乳劑注冊申報注意事項文章：審評三部 張寧  注冊分類五中的特殊情況。

對于制劑而言，處方工藝篩選是整個研究過程中的前期工作和重點工作，建議申辦者能供詳盡的處方工藝篩選過程,并附有翔實的試驗數(shù)據(jù)和結(jié)果分析。如上資料，從申報者的角度考慮，是對最終確定的處方工藝的合理性進行充分的闡述，從審評者的角度考慮，這是評價的基礎。其中，需提醒重點關(guān)注的是關(guān)于滅菌工藝的選擇和驗證，如上制劑由于輔料的不穩(wěn)定性（例如磷脂易氧化降解）、劑型的不穩(wěn)定性（例如乳劑的分層問題）等，導致滅菌工藝的選擇比較困難，故提請申辦單位對最終選擇的滅菌工藝進行驗證，證明所用滅菌工藝既能保證產(chǎn)品達到無菌效果，又不影響產(chǎn)品質(zhì)量。

1.5中國藥審中心2004年11月11日兩個腫瘤藥物脂質(zhì)體品種的專家咨詢會。

處方工藝的篩選指標應全面，需綜合考慮包封率、滲漏率、粒徑、穩(wěn)定性（包括產(chǎn)品的穩(wěn)定性和脂質(zhì)材料的穩(wěn)定性）等因素。對于關(guān)鍵的工藝條件和工藝步驟應進行驗證，說明工藝的合理性和重現(xiàn)性。對所用的工藝設備應給予明確說明，并對放大生產(chǎn)的可行性進行論證。

1.6 CFDA 發(fā)布《藥物注射劑研發(fā)技術(shù)指導意見》征求意見稿2018年

滅菌/無菌生產(chǎn)工藝是注射劑的關(guān)鍵工藝步驟，須依據(jù)滅菌決策樹選擇合理的滅菌/無菌生產(chǎn)工藝，對滅菌/無菌工藝進行驗證，并提供在擬定的工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模生產(chǎn)線進行的工藝驗證方案和報告。關(guān)注特殊類型注射劑生產(chǎn)過程中影響制劑特性的工藝因素，對生產(chǎn)工藝進行驗證，并提供在擬定的商業(yè)化生產(chǎn)線進行的工藝驗證方案和報告。申報上市的注冊批應該確實保證產(chǎn)品和工藝過程具有工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模下的可行性，并提供驗證資料。對特殊類型注射劑，注冊批生產(chǎn)規(guī)模一般至少是工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模的五分之一或至少生產(chǎn)1000支/瓶，兩者中選較大者。對工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模少于1000支/瓶的特殊品種，注冊批生產(chǎn)規(guī)模應與工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模一致。

2. 被動與主動載藥工藝

藥物加入脂質(zhì)體有兩種工藝。被動載藥，藥物在制備過程中被包封在脂質(zhì)體里。主動載藥，藥物裝載到完整的脂質(zhì)體中。

2.1被動載藥工藝

能否采用被動載藥工藝，取決于脂質(zhì)體在形成期間包封特定體積水相的能力，一般在水相中含有溶解的藥物。親水藥物，經(jīng)被動載藥脂質(zhì)體包封率與脂質(zhì)體所在的水相體積有關(guān)，脂質(zhì)體本身性質(zhì)取決于分散體系的磷脂濃度、層室數(shù)和脂質(zhì)體形態(tài)。親脂性藥物與磷脂雙層有相互作用，包封率取決于磷脂類別及其濃度。形態(tài)學參數(shù)不影響藥物包封率。使用被動載藥技術(shù)，水溶性藥物被包裹在脂質(zhì)體的水相內(nèi)，而脂溶性藥物被包裹在脂質(zhì)相中。藥物脂溶性部分將嵌入脂質(zhì)體磷脂之間，而它們的水溶性部分位于脂質(zhì)體水相中，從而被包封。

2.2主動載藥工藝

主動載藥是將已經(jīng)制備的空白脂質(zhì)體與藥物濃溶液混合，孵育后，藥物擴散均勻分布在脂質(zhì)體中。磷脂層對藥物擴散具有高度滲透性，能獲得較高包封率。由于濃度梯度，藥物可通過脂質(zhì)雙層滲透到脂質(zhì)體中，直到周圍介質(zhì)和脂質(zhì)體內(nèi)部之間達到平衡。主動載藥，水溶性藥物無法進入脂質(zhì)體內(nèi)部。能夠進入脂質(zhì)體的疏水性藥物的量，取決于脂質(zhì)雙層的空間限制程度。對于兩親性藥物的情況，它們難以保留在脂質(zhì)體內(nèi)，因為它們可以快速滲透脂質(zhì)雙層。主動載藥的缺點在于它僅限一小部分表現(xiàn)為兩性弱堿性或酸性的藥物，只能在不帶電的情況下滲透雙層，而不能在帶電的情況下滲透。

3.比較常用的制備工藝：

3.1溶劑注入法

溶劑注入法是比較常用的一種制備脂質(zhì)體的方法，一般可將膜材分散在乙醇或Y醚中，再將溶液注入藥物的水溶液中，揮盡溶劑后再勻化或超聲就可得到脂質(zhì)體。所得脂質(zhì)體囊泡的平均直徑與磷脂的性質(zhì)、脂質(zhì)與藥物的比例，以及水相和有機溶劑組成有關(guān)。此方法相比于其他方法可以避免使用氯仿等有毒溶劑，并且以安全價廉的乙醇作為溶劑也更有利于大規(guī)模推廣。但是該法目前也還存在溶劑殘留難去除的問題。有人認為醚注入法優(yōu)于乙醇注入法。

3.1.1乙醇注入法

含脂質(zhì)的乙醇溶液快速注入過量的水相中。注入力須足以使溶液*混合。乙醇在水相中被稀釋，使得脂質(zhì)在水相中均勻分散。能制備小單層脂質(zhì)體囊泡。此外，該方法簡單易行，適用于敏感脂質(zhì)，因為它可以防止其降解。缺點是磷脂在乙醇中溶解度有限同時脂質(zhì)膜中乙醇不易*除去。

3.1.2醚注入法

將與脂質(zhì)混溶的Y醚緩慢注入水相中，在一定溫度下Y醚緩慢蒸發(fā)，導致醚與水的梯度延伸到界面脂質(zhì)單層膜的兩側(cè)，形成的雙層膜，折疊形成封閉的囊泡。此法能產(chǎn)生大的脂質(zhì)體囊泡。醚注入法可避免了敏感的磷脂被氧化降解。缺點是單批脂質(zhì)體所需的時間較長及需要小心控制脂質(zhì)溶液的加入。

3.2薄膜分散法

薄膜分散法是將藥物溶于有機溶劑后，減壓除去溶劑，使脂質(zhì)在容器壁上形成薄膜，再加入含有水溶性藥物的緩沖溶液，充分振搖后得到脂質(zhì)體。但是此法要使用大量的有機溶劑，耗時長。該法分散的磷脂會在水性緩沖液中產(chǎn)生形狀和尺寸較大（直徑為1-5μm）的多層脂質(zhì)體。因此，需要使用超聲處理或通過聚碳酸酯濾器的技術(shù)，來降低脂質(zhì)體尺寸，產(chǎn)生尺寸更小、更均勻的脂質(zhì)體。它的缺點是大多數(shù)水溶性化合物在溶脹過程中會被洗除，因此，只有10%-15%的水溶性物質(zhì)可被包封。國內(nèi)王溪淼用薄膜分散法制備卡培他濱與奧沙利鉑復方脂質(zhì)體。邢宇等用薄膜分散超聲法制備銀杏內(nèi)酯B脂質(zhì)體。

3.3逆向蒸發(fā)法

將膜材的有機溶液與藥物水溶液超聲形成W/O型乳液，再減壓蒸發(fā)，就可得到脂質(zhì)體。此法適用于水溶性藥物和大分子活性物質(zhì)。將磷脂與有機溶劑一起加入圓底燒瓶中。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在減壓和控制溫度條件下，通過蒸發(fā)除去溶劑。用氮氣吹掃，并將脂質(zhì)重新溶解在有機相中。異丙醚和二Y醚是這種脂質(zhì)體制備方法的溶劑。在重新溶解脂質(zhì)后，獲得乳液。在減壓下從乳液中除去有機溶劑后形成半固體凝膠。除去游離的或未包封的藥物，獲得的脂質(zhì)體稱為逆相蒸發(fā)脂質(zhì)體。該法制備的脂質(zhì)體藥物的包封率較高。

3.4冷凍干燥法

冷凍干燥的方法可用于制備無菌和無熱原的亞微米小尺寸脂質(zhì)體。將磷脂/膽固醇溶解于適宜的有機溶劑中，常用的是叔丁醇，之后冷凍干燥得到疏松的粉末，將之水化后，則可以得到脂質(zhì)體。得到的脂質(zhì)體仍為納米級的不均勻的脂質(zhì)體。如需要，可以采取前述部分的方法，對其進行后處理。此種方法可以產(chǎn)業(yè)化，并且使用的叔丁醇毒性和乙醇相似，無安全問題。凍干制劑臨床使用前進行超聲處理。例如張曉云等人采用有機溶劑凍干法制得鬼臼毒素凍干脂質(zhì)體，包封率達到93.72%。羅霄等人采用有機溶劑凍干法制備燈盞花素脂質(zhì)體，制備3批脂質(zhì)體，包封率平均為87.5%。

3.5超臨界流體法

將壓縮二氧化碳氣體、有機助溶劑和脂質(zhì)放入溫度高于脂質(zhì)轉(zhuǎn)變溫度的攪拌反應釜中，然后緩緩注入水相。當釋放壓縮氣體降低壓力時，形成脂質(zhì)體。改良的超臨界流體逆相蒸發(fā)技術(shù)可提高了載藥效率和脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。

已有報道采用亞臨界或臨界或超臨界的二氧化碳作為溶劑生產(chǎn)脂質(zhì)體的方法和專用設備。將脂質(zhì)體的原料混合，如磷脂、膽固醇、脂溶性活性成份等混合后加入到可封閉的罐中，再向罐中加入CO2，并使罐中溫度和壓力達到亞臨界或臨界或超過CO2的臨界溫度和壓力，溶解脂質(zhì)體的原料后釋放罐中的CO2，使罐中壓力降低至略高于常壓。向罐中加入分散液，浸泡或攪拌形成包裹有脂溶性活性成份的脂質(zhì)體。

3.6 pH值梯度法

首先根據(jù)藥物的性質(zhì)選擇內(nèi)向緩沖液和外向緩沖液。如果藥物為生物堿，則內(nèi)向緩沖液則應為酸性緩沖液，外相緩沖液的pH值應接近生理pH值。通常使用的酸性緩沖液應為多元有機酸，如枸櫞酸、酒石酸等；要求藥物能夠和有機酸根復合形成膠態(tài)沉淀。而外相緩沖液則應可以很好的溶解待包封藥物，并且其pH能夠保證絕大多數(shù)藥物以非離解的形式存在，以便在加熱孵育的過程中可以有效地穿透磷脂雙分子層。篩選合適的內(nèi)外相緩沖液的組合是非常重要的，因為它直接決定了藥物在儲存期內(nèi)的穩(wěn)定性和藥物在體內(nèi)的釋放行為。確定內(nèi)外相緩沖液后，就可以制備空白脂質(zhì)體

篩選合適的內(nèi)外相緩沖液的組合是重要的，因為它直接決定了藥物在儲存期內(nèi)的穩(wěn)定性和藥物在體內(nèi)的釋放行為。

硫酸銨梯度是pH梯度常用的一種。以硫酸銨緩沖液為介質(zhì)制備空白脂質(zhì)體，經(jīng)過透析后，在內(nèi)外水相產(chǎn)生硫酸銨梯度，當脂質(zhì)體雙分子膜內(nèi)的硫酸銨濃度遠遠大于外水相中的硫酸銨濃度時，內(nèi)水相中的銨離子解離，從而使內(nèi)水相pH降低，建立pH梯度。弱堿性藥物以分子狀態(tài)進入內(nèi)水相，并在酸性條件下成鹽，無法穿過磷脂雙分子層返回外水相。藥物成鹽消耗掉內(nèi)水相中的氫離子，從而使內(nèi)水相pH增加，繼續(xù)產(chǎn)生游離的氨分子。氨分子跨膜外逸形成pH梯度。上述過程不斷進行直至內(nèi)水相中氨離子消失，達到電化學平衡狀態(tài)。與普通的pH梯度法相比，硫酸銨梯度法脂質(zhì)體不易因外界pH的改變而泄露，被包裹入脂質(zhì)體內(nèi)水相的藥物一般為弱堿性，可與硫酸根形成具有更低溶解性的鹽，在脂質(zhì)體內(nèi)部聚集，使其比普通pH梯度法更加穩(wěn)定，包封率更高。藥物包封主要取決于內(nèi)水相與外水相中硫酸銨濃度的比值。王紹寧等人分別采用薄膜分散法、逆相蒸發(fā)法、乙醇注入法和硫酸銨梯度法制備鹽酸環(huán)丙沙星脂質(zhì)體，結(jié)果表明硫酸銨梯度法制備脂質(zhì)體的包封率（＞90 %），明顯高于前3種方法制備得脂質(zhì)體（＜40 %）。國外多柔比星脂質(zhì)體注射液(Doxil, 1995)采用硫酸銨梯度法制備工藝。

蔗糖八硫酸鹽梯度載藥法近期也有一些報道。2015年上市的伊立替康脂質(zhì)體Onivyde®，即采用蔗糖八硫酸鹽梯度載藥，使得伊立替康在弱酸性內(nèi)水相中以沉淀形式被穩(wěn)定包載。Onivyde®所用磷脂輔料DSPC、膽固醇、DSPE-mPEG2000以及蔗糖八硫酸酯鹽，中國艾偉拓公司均完成/計劃完成CDE和DMF登記。

此外制備脂質(zhì)體的工藝還有復乳法、熔融法、表面活性劑處理法、離心法、前體脂質(zhì)體法、鈣融合法、加壓擠出法、微射流法、膜接觸器法、微流控，高壓均質(zhì)法等。

4.近期國內(nèi)脂質(zhì)體研究制備工藝

目前國內(nèi)報道的脂質(zhì)體制備工藝已薄膜分散法為多，還有逆向蒸發(fā)法，載體沉積法和冷凍干燥法等。

例如，嵇晶等用逆向蒸發(fā)法制備丹參總酚酸復合磷脂脂質(zhì)體。張璐等用薄膜分散法制備紫杉醇五味子乙素脂質(zhì)體。呂佳佳等用薄膜分散超聲法制備紫杉醇/姜黃素雙載藥脂質(zhì)體。周婷等用薄膜分散法制備羥基喜樹堿脂質(zhì)體。張麗用薄膜分散法并冷凍干燥制備卡巴他賽脂質(zhì)體。沈貝莉莎用薄膜水化法并凍干制備紫杉醇脂質(zhì)體。方曉旭等用冷凍干燥法制備硬脂醇半乳糖苷修飾的阿西替尼脂質(zhì)體。隋琳等以載體為甘露醇，用載體沉積法制備兩性霉素前體脂質(zhì)體。

經(jīng)過幾十年的發(fā)展，脂質(zhì)體制備工藝的研究已經(jīng)取得很大的進步，切向流過濾法，薄膜分散法、逆相蒸發(fā)法、注入法、超聲波分散法、pH梯度法、硫酸銨梯度法、醋酸鈣梯度法及其他離子梯度法的相繼問世拓展了脂質(zhì)體工藝新思路。脂質(zhì)體屬于*靠工藝控制藥品質(zhì)量的產(chǎn)品；關(guān)鍵工藝步驟：如乳化工藝、溶劑去除工藝、載藥工藝、過濾工藝等關(guān)鍵步驟最好全部自動化操作，杜絕人為因素引起的工藝偏差。相信隨著制備工藝設備和條件的日益成熟，脂質(zhì)體制備工藝水平將會有更廣闊的發(fā)展空間。