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光學(xué)顯微鏡的主要觀察方法及使用技巧
閱讀：4399 發(fā)布時間：2021-12-15
我們平時用到的正置顯微鏡和倒置顯微鏡，統(tǒng)稱為復(fù)合式顯微鏡，可以用來觀察涂片或切片、培養(yǎng)的活細(xì)胞、水中的微生物或進(jìn)行顯微操作等。顯微鏡主機(jī)搭配各種光學(xué)組件可以實現(xiàn)各種觀察方法：明場、相差、暗場、微分干涉（DIC）、整合調(diào)制反差（IMC）等，針對不同的標(biāo)本，選用適合的觀察方法才能得到的圖像。
明場觀察
通常所說的明場，指的是由顯微鏡光源的照明光經(jīng)過聚光鏡匯聚照射到標(biāo)本上，被標(biāo)本吸收后，剩余的光進(jìn)入物鏡，然后通過目鏡被人眼看到或者被通過C接口被攝像頭拍到。照明光路采用科勒照明或臨界點照明。
血涂片、革蘭氏染色的細(xì)菌涂片、染色的病理切片、植物的切片、骨磨片等都采用明場方式觀察。這幾類標(biāo)本比較適合用正置顯微鏡觀察，與倒置顯微鏡相比，正置顯微鏡的聚光鏡可以離標(biāo)本很近，數(shù)值孔徑比較大，所以整體的分辨率要比倒置鏡高，看標(biāo)本更清楚。
明場觀察的要求主要是結(jié)構(gòu)清晰、顏色準(zhǔn)確，如何保證清晰準(zhǔn)確呢？
首先是制片，為了盡可能的看到清晰的結(jié)構(gòu)，我們先注意一下標(biāo)本制備中要不要封片以及如何封片的問題，因為不同的物鏡對標(biāo)本封片與否的要求是不一樣的。
1.光學(xué)顯微鏡中物鏡上的重要參數(shù)
對于需要封片的標(biāo)本，標(biāo)本要浸沒在封片劑中，再蓋上蓋玻片，不可以不加封片劑直接蓋蓋玻片。封片劑的折射率一般與標(biāo)本接近，盡量減少成像光路中折射率的突兀變化，以保證通透性。生物組織的折射率一般在1.3~1.5之間，蓋玻片的玻璃折射率為1.52左右，油鏡的油折射率為1.518，所以封片劑的折射率一般不超過1.518。
2.光學(xué)顯微鏡制片
其次是顯微鏡組件參數(shù)，數(shù)值孔徑（NA）是物鏡和聚光鏡的固有參數(shù)，物鏡的數(shù)值孔徑（NA）越大分辨率越高，看到的標(biāo)本就越清楚。同樣，聚光鏡的數(shù)值孔徑越大分辨率越高。所以選擇數(shù)值孔徑比較大的物鏡和聚光鏡有助于看清更多的標(biāo)本細(xì)節(jié)孔徑光闌（Aperture）位于聚光鏡上，孔徑數(shù)值可調(diào)，也影響分辨率，孔徑數(shù)值越大顯微鏡成像分辨率越高。
3.孔徑光闌
注意：物鏡和聚光鏡的數(shù)值孔徑越大，其工作距離（或者理解為焦距）越短?？讖焦怅@數(shù)值越大，顯微鏡成像的對比度越低，景深越小。
4.另外，照明光源的色溫會影響到顯色效果。同一個標(biāo)本，照明色溫比較低時，標(biāo)本中的紅色就比較鮮艷，藍(lán)色比較暗；相反色溫偏越高時，標(biāo)本中藍(lán)色就越鮮艷紅色越暗。
顯微鏡常用作明場照明的光源有兩種：鹵素?zé)艉蚅ED燈。
鹵素?zé)舻恼w色溫比較低，看起來明顯偏黃色，一般會在照明光路里加一個日光濾片提高色溫，使標(biāo)本的顏色更均衡。然而鹵素?zé)舻纳珳貢S著燈的亮度而變化，燈調(diào)節(jié)的越亮，色溫越高。我們知道在使用顯微鏡從低倍物鏡轉(zhuǎn)換到高倍物鏡時，需要調(diào)亮照明光來保證目鏡觀察到的視野亮度一致，這樣就會導(dǎo)致色溫升高，從而使得高倍鏡看到的標(biāo)本中藍(lán)色結(jié)構(gòu)比低倍鏡中更鮮艷，而低倍鏡中看到的紅色結(jié)構(gòu)更鮮艷。要解決這個色彩偏差，方法有：
基礎(chǔ)的顯微鏡可以配置恒定亮度的物鏡組，低倍鏡跟高倍鏡的亮度一樣，這樣就不需要調(diào)整燈的亮度。
高級的全自動顯微鏡使用恒定色溫轉(zhuǎn)輪，根據(jù)不同物鏡自動調(diào)整鹵素?zé)袅炼炔⒆詣诱{(diào)節(jié)色溫轉(zhuǎn)輪，來使最終的照明色溫保持恒定。
使用恒定色溫的照明光源：LED燈。
LED燈的色溫恒定，不會隨亮度變化。顯微鏡明場照明用的LED燈通常色溫恒定在５０００Ｋ，接近太陽光的平均色溫。
最后使用顯微鏡配備的攝像頭拍照時，如果發(fā)現(xiàn)電腦屏幕上呈現(xiàn)的圖像偏色，就需要先做一下白平衡。
4選取視野中的空白區(qū)域作為參照進(jìn)行白平衡，顏色的鮮艷程度則可以通過色飽和度調(diào)節(jié)，飽和度越高，圖像色彩越艷麗，飽和度低時，圖像就失去色彩呈現(xiàn)為黑白色。
需要注意的是，不必要求屏幕上顯示的標(biāo)本顏色跟目鏡里看到的*一致，因為任何顯示器所能顯示的顏色都是有限的，
5.人眼與不同顯示器觀察到的色域不同相差成像檢查培養(yǎng)中的活細(xì)胞的生長狀態(tài)時，常用相差方法觀察。因為活細(xì)胞一般不染色，細(xì)胞比較透明，直接用明場觀察的話不容易看清楚，用相差方式可以提高反差，更容易看清細(xì)胞狀態(tài)。
6活細(xì)胞觀察對比顯微鏡要實現(xiàn)相差效果需要兩個條件：相差物鏡和相差環(huán)，觀察時需要選擇相差物鏡并將對應(yīng)的相差環(huán)移入光路。相差物鏡上會有標(biāo)志“PH０”、“PH１”、“PH２”等，數(shù)字表示對應(yīng)的相差環(huán)型號，另外相差環(huán)上也會明確標(biāo)注對應(yīng)的物鏡倍數(shù)，使用相差時一定要保證物鏡和相差環(huán)正確匹配。
7.相差成像設(shè)備圖解
暗場成像
實際是暗場照明法。不直接觀察到照明的光線，而觀察到的是被物體反射或散射的光線，暗背景，樣品閃亮。適合觀察微小水生生物、纖維、毛發(fā)、細(xì)菌，以及進(jìn)行尿檢等。
8.明暗成像對比
9.暗場成像下的小水生生物
暗場觀察所需要的特殊附件是暗場環(huán)和聚光鏡，聚光鏡的數(shù)值孔徑至少比所用物鏡大０.２才可以實現(xiàn)較好的暗場效果。
10.暗場成像原理
微分干涉（DIC）成像如果細(xì)胞標(biāo)記了熒光，就不太適合再用相差物鏡觀察了，因為相差物鏡內(nèi)有相位環(huán)，會阻擋部分熒光，此時比較適合的反差增強(qiáng)方法是DIC。DIC可以用高透光的復(fù)消色差物鏡搭配DIC棱鏡和偏光片來實現(xiàn)，拍攝熒光時DIC組件可以從光路中移除，不會對熒光成像產(chǎn)生影響。
DIC呈現(xiàn)出漂亮的3D圖像（非真實三維圖像），無光暈，分辨率大于相差，適合搭配熒光，但是不適合在塑料器皿中成像。
DIC下的細(xì)胞成像
DIC成像時需要在光路中移入４個組件，相對比較復(fù)雜，所以一般配在全自動顯微鏡上，由顯微鏡自動控制各個組件，以方便使用者操作。并可實現(xiàn)長時間定時拍攝，記錄動態(tài)過程。
整合調(diào)制反差（IMC）成像
顯微操作時，需要標(biāo)本呈現(xiàn)出一定的立體效果，DIC雖然有立體效果，但是用DIC時不能用塑料器皿，而顯微操作多數(shù)都是在塑料器皿里進(jìn)行的。整合調(diào)制反差（IMC）或者霍夫曼反差（HMC）正好滿足這個需求。
IMC或者HMC是一種斜照明效果，一側(cè)的狹縫照明造成陰影，產(chǎn)生立體效果?？捎糜谒芰掀髅髢?nèi)標(biāo)本的顯微操作。
IMC成像適用于顯微操作
HMC需要專用的物鏡搭配聚光鏡上的調(diào)制器，專用物鏡對熒光有一定的阻擋。IMC無需專用物鏡，可用普通物鏡搭配調(diào)制器實現(xiàn)，對熒光成像沒有影響。