技術(shù)原理

細胞凋亡是細胞的基本特征，在機體的胚胎發(fā)育、組織修復(fù)、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定等方面都起到十分重要的作用。

在正常的活細胞中，磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine，PS）位于細胞膜的內(nèi)側(cè)，但在早期凋亡的細胞中，PS 從細胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中。Annexin-Ⅴ（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為35-36 kDa的Ca2+ 依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力結(jié)合，可通過細胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結(jié)合。

碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）用來區(qū)分存活的早期細胞和壞死或晚期凋亡細胞。PI是一種核酸染料，它不能透過正常細胞或早期凋亡細胞的完整的細胞膜，但可以透過凋亡晚期和壞死細胞的細胞膜而使細胞核染紅。因此，將Annexin V與PI聯(lián)合使用時，PI 則被排除在活細胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡細胞（Annexin V+/PI-）之外，而晚期凋亡細胞和壞死細胞同時被FITC 和PI 結(jié)合染色呈現(xiàn)雙陽性（Annexin V+/PI+）。

實驗方法

Step1：細胞培養(yǎng)

Step2：轉(zhuǎn)染或藥物處理

Step3：細胞收集

Step4：加凋亡試劑

Step5：上機檢測

案例展示

技術(shù)總結(jié)

1、考慮到進行流式時需要用到對照組細胞設(shè)置空白組（用于調(diào)節(jié)電壓）和單染組細胞（用于調(diào)節(jié)補償），因此要求該組細胞量較其他組多

2、如發(fā)現(xiàn)細胞密度偏低，細胞量較少，則適當(dāng)增加離心時間。收集細胞時，應(yīng)該連同上清一起收集，同時胰酶消化時間不宜過長，否則容易引起假陽性

3、檢測細胞經(jīng)過轉(zhuǎn)染等處理后可能會帶有自發(fā)熒光，應(yīng)注意選擇凋亡試劑盒的顏色通道 如：帶綠色熒光時，應(yīng)選擇7AAD試劑盒

4、細胞鋪板應(yīng)選擇細胞狀態(tài)良好的時候進行，且避免反復(fù)吹打

5、流式檢測細胞樣本：細胞樣品準(zhǔn)備時，使用不含EDTA的胰酶消化細胞，不得使用細胞刮刀進行操作，胰酶消化細胞時切忌消化過頭或沒有打開細胞間隙