澳洲源胎牛血清(F8687-500ML)

產(chǎn)品名稱：澳洲胎牛血清

貨號：F8687

規(guī)格：500ml

品牌：SIGMA

細(xì)胞培養(yǎng)最基本的是做好污染防控，包括微生物污染的防控和細(xì)胞系間交叉污染的防控。

實驗中需保持良好的操作習(xí)慣，所用材料的位置擺放要順手，污染源和已滅菌物品要分開放置。實驗室也需定期清潔與消毒。

※血清與培養(yǎng)基

通常血清的添加比例為10%，當(dāng)然也可根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)和生長速率適當(dāng)增加或減少添加比例。在更換血清品牌或者批次時，最好需對血清的品質(zhì)進(jìn)行驗證，防止對實驗造成影響。

對于培養(yǎng)基，目前商品化的比較成熟，穩(wěn)定性也較好。如若需自配培養(yǎng)基時，過濾前攪拌時間不宜過長（培養(yǎng)基中營養(yǎng)豐富，細(xì)菌常溫下20min就可繁殖一代，其代謝產(chǎn)物會對培養(yǎng)基的品質(zhì)產(chǎn)生影響）。培養(yǎng)基過濾除菌后，應(yīng)對培養(yǎng)基進(jìn)行無菌驗證，防止污染。

※細(xì)胞培養(yǎng)瓶

目前商品化的細(xì)胞培養(yǎng)瓶主要為瓶蓋是否帶氣孔兩種。其中不帶透氣孔細(xì)胞培養(yǎng)瓶擰緊后需適當(dāng)回旋瓶蓋，保證CO2能順利進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)瓶。

細(xì)胞培養(yǎng)過程中，對于適應(yīng)能力強的腫瘤細(xì)胞，可在傳代3-4次后更換新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶。對于非腫瘤細(xì)胞系如293T，HEK293等細(xì)胞，建議每次傳代更換新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶來保證細(xì)胞狀態(tài)。

※細(xì)胞傳代

正常細(xì)胞形態(tài)較好，輪廓清晰，邊緣透亮，細(xì)胞增殖狀況良好。當(dāng)貼壁細(xì)胞長到密度90%時，需進(jìn)行傳代。

傳代時通常使用胰酶消化法。該方法又分為干消化法和濕消化法。

干消化法：胰酶浸潤后棄去胰酶，待細(xì)胞變圓后加入新鮮培養(yǎng)基吹下后再進(jìn)行細(xì)胞傳代。

濕消化法：待細(xì)胞變圓，肉眼觀察下成流沙狀脫落時即可加入新鮮培養(yǎng)基終止消化，1000rpm離心5min,棄去上清，用新鮮培養(yǎng)基重懸傳代。

吹打細(xì)胞時，手法要輕柔，避免吹打出氣泡，造成細(xì)胞因內(nèi)外壓差破裂，同時需避免刮到瓶壁影響細(xì)胞的貼壁。

不同細(xì)胞的貼壁能力不同，消化時間不同；不同細(xì)胞細(xì)胞間連接強度不一樣，消化時間不同；同一細(xì)胞生長狀狀況不同，消化時間不同。消化時適時觀察細(xì)胞形態(tài)，避免因過度消化影響細(xì)胞活性。

傳代間隔時間和傳代比例因細(xì)胞而異。細(xì)胞傳代過程中，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)狀態(tài)不好或者污染時及時棄去細(xì)胞，重新復(fù)蘇。

※細(xì)胞凍存與復(fù)蘇

當(dāng)細(xì)胞生長狀況較好或者代數(shù)較早時，需及時大量的凍存。

細(xì)胞凍存液比例為培養(yǎng)基：血清：DMSO=7:2:1，也可血清：DMSO=9:1。細(xì)胞凍存密度通常為1-3×106個/ml。細(xì)胞凍存采用慢凍方式，減少冰晶形成，避免細(xì)胞損傷。通常4℃放置0.5 h，-20℃放置2 h，-80℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)。

細(xì)胞復(fù)蘇時升溫要快，防止在解凍過程中水分進(jìn)入細(xì)胞，形成冰晶，影響細(xì)胞存活。38℃水浴不時搖動，在1分鐘內(nèi)使其*融化，1000rpm離心5min,棄去上清，用新鮮培養(yǎng)基重懸移入培養(yǎng)瓶中。

※用真誠感動細(xì)胞

俗話說，心誠則靈。對待細(xì)胞培養(yǎng)也應(yīng)如此，“自己要用的細(xì)胞自己養(yǎng)"，多去觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。

所謂“知彼知己，百戰(zhàn)不殆"。培養(yǎng)細(xì)胞需要我們的耐心以及不斷的摸索和積累，了解了每種細(xì)胞各自的習(xí)性后，再“傲嬌"的細(xì)胞也能在我們的“真誠"下認(rèn)真“成長"※※※※

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貼壁細(xì)胞傳代：

1）移棄使用過的細(xì)胞培養(yǎng)液。（不要直接倒掉，避免瓶口殘留導(dǎo)致易污染）

2）使用不含鈣鎂離子的平衡鹽溶液（PBS）沖洗細(xì)胞。從與貼壁細(xì)胞層相對的容器一側(cè)輕輕加入沖洗液，以避免攪動細(xì)胞層，前后搖晃容器數(shù)次，最后移棄沖洗液。（洗去殘留的血清，避免影響胰酶的活性。）

3）以 25 cm2的培養(yǎng)瓶為例，向瓶內(nèi)加入1ml胰蛋白酶-EDTA（請根據(jù)各細(xì)胞的指引使用合適的濃度）消化液，輕輕搖動培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有細(xì)胞表面，放到37 ℃ 孵育。通常，幾分鐘內(nèi)，會發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大，傾斜培養(yǎng)瓶時細(xì)胞層能自然流下，此時應(yīng)加入2-3ml含血清的*培養(yǎng)液終止消化（細(xì)胞解離所需時間請參考各細(xì)胞的指引，并建議每隔30秒在顯微鏡下觀察細(xì)胞的解離情況）。另外，并不是所有貼壁細(xì)胞都適用采用胰蛋白酶進(jìn)行解離，請根據(jù)各細(xì)胞的指引選擇合適的解離方法。

4）使培養(yǎng)瓶傾斜，吸取培養(yǎng)瓶內(nèi)液體輕輕沖向原細(xì)胞生長表面，重復(fù)該動作2-3次，使所有細(xì)胞沿瓶底流下，再輕柔地把細(xì)胞吹打成單個懸液（吹打過程中應(yīng)避免氣泡的產(chǎn)生）。

PS：對于難消化的細(xì)胞，盡量不要通過用力吹打的方式來處理，以免對細(xì)胞產(chǎn)生物理損傷。可以先將已經(jīng)消化的細(xì)胞分出來，及時終止消化。然后再對仍然貼壁的細(xì)胞進(jìn)行再次消化。做到分層消化，避免易消化細(xì)胞長時間在胰酶消化下受損。

5）把所有的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，800-1000rpm離心3-5分鐘后移棄上清。

6）加入新的含血清*培養(yǎng)液重懸成單細(xì)胞懸液。按各細(xì)胞指引推薦的傳代比例，把細(xì)胞懸液均勻分到各培養(yǎng)器皿中，補足新的含血清*培養(yǎng)液，輕輕搖晃混勻。

7）放到37 ℃ 孵育，第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞的貼壁情況。

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