生物墨水類型概述

生物墨水是用于3D生物打印的生物材料。生物墨水的材料特性會(huì)影響其與細(xì)胞的相互作用及其作為生物打印結(jié)構(gòu)的成功。理解生物打印中使用的各種材料的一種方法是按它們?cè)诖蛴∵^程中的角色對(duì)它們進(jìn)行分類。給定的生物墨水可以是基質(zhì)墨水、支撐墨水或犧牲墨水。

基質(zhì)墨水

基質(zhì)生物墨水保持和支持細(xì)胞，在生物打印中起著重要作用。大多數(shù)基質(zhì)生物墨水是水凝膠，這意味著它們主要由水組成。目前市場(chǎng)上的生物墨水具有優(yōu)勢(shì)和劣勢(shì)，通常滿足生物打印所需的部分但不是全部要求。其他類別的試劑可以幫助彌補(bǔ)這些弱點(diǎn)。有關(guān)基質(zhì)油墨的一些示例及其主要用途。

支撐墨水

支持生物墨水是生物相容性材料，比基質(zhì)墨水具有更好的機(jī)械性能。通常使用支持油墨來支持生物打印結(jié)構(gòu)，因?yàn)樗z往往柔軟且結(jié)構(gòu)完整性低。支持生物墨水也常用于結(jié)締組織或硬組織應(yīng)用，例如軟骨、骨骼或肌肉組織的制造。有關(guān)支撐油墨及其使用條件的一些示例，請(qǐng)參見下表。

犧牲墨水

顧名思義，犧牲生物墨水被設(shè)計(jì)為作為臨時(shí)支撐物沉積，然后在后處理中移除。它們通常用于創(chuàng)建復(fù)雜的負(fù)幾何形狀，例如血管網(wǎng)絡(luò)。在某些情況下，它們還可以用于提高使用本身形狀保真度較差的材料制成的打印件的分辨率。有關(guān)支撐油墨及其使用條件的一些示例，請(qǐng)參見下表。

支撐墨水

雖然支撐和犧牲生物墨水可以提供持續(xù)或臨時(shí)的加固，但這無助于僅由軟水凝膠或其他幾何復(fù)雜組成的結(jié)構(gòu)。像FRESH這樣的方法涉及打印到支撐槽中，從而能夠創(chuàng)建這樣的結(jié)構(gòu)。

近端小管 STL 文件（左）、FRESH 漿液中的生物打印小管（中）、FRESH 后處理的小管（右）

交聯(lián)固化劑

通過將細(xì)胞封裝在生物墨水中，細(xì)胞能夠在活組織中生長(zhǎng)和重塑生物打印結(jié)構(gòu)。使用天然生物墨水可以幫助他們做到這一點(diǎn)，因?yàn)樗刑烊坏鞍踪|(zhì)。蛋白質(zhì)對(duì)不同的組織類型是不同的，并增加了生物墨水的特異性，使它們能夠針對(duì)特定應(yīng)用進(jìn)行定制。玻連蛋白或纖連蛋白等蛋白質(zhì)在體內(nèi)用于調(diào)節(jié)細(xì)胞行為，如粘附、遷移、增殖和分化，并介導(dǎo)與膠原蛋白、肝素和GAG的相互作用。

光引發(fā)劑

光交聯(lián)是增加基質(zhì)油墨硬度的幾種交聯(lián)選項(xiàng)之一，這在某些結(jié)構(gòu)中是可取的。特別是光交聯(lián)利用電磁輻射中的能量來激活硬化過程。光引發(fā)劑是將必要的自由基引入基質(zhì)生物墨水以允許光交聯(lián)的物質(zhì)。它們主要在可以激活它們的電磁頻譜范圍內(nèi)有所不同。

3D模型指南

在3D打印之前，你必須知道這個(gè)物體是什么樣子的。無論該對(duì)象是簡(jiǎn)單的測(cè)試圓柱體還是復(fù)雜的血管網(wǎng)絡(luò)，您通常都從 3D 模型開始，將該模型轉(zhuǎn)換為 STL 文件，然后將該 STL 文件轉(zhuǎn)換為 G 代碼文件，您的打印機(jī)會(huì)將其解釋為電機(jī)運(yùn)動(dòng)。下面，我們將討論如何將您的打印對(duì)象從想法轉(zhuǎn)化為 STL。

自己設(shè)計(jì)

有許多程序可以讓您自己設(shè)計(jì) 3D 模型。這些通常被稱為CAD（計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)）程序。SolidWorks、Inventor 和 AutoCAD 都是流行的選項(xiàng)，但您可以探索很多選項(xiàng)。設(shè)計(jì)自己的模型的主要優(yōu)點(diǎn)是可以控制形狀。將模型雕刻成您喜歡的規(guī)格后，您可以將 CAD 文件另存為 STL 文件，然后就可以繼續(xù)切片了。

從醫(yī)學(xué)影像轉(zhuǎn)換

許多研究人員在開發(fā) 3D 模型時(shí)使用的另一種技術(shù)是將醫(yī)學(xué)成像樣本轉(zhuǎn)換為 STL 文件。CT 掃描是常見的轉(zhuǎn)換成像類型，但可以使用大多數(shù)形式，特別是如果它們可以保存為 DICOM（醫(yī)學(xué)數(shù)字成像和通信）文件。轉(zhuǎn)換由軟件執(zhí)行，該軟件將成像樣品中記錄的光強(qiáng)度轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的組織類型，并確定組織之間的邊界。Mimics、3D Slicer 和 InVesalius 3 等程序都是流行的選擇。轉(zhuǎn)換醫(yī)學(xué)成像結(jié)果的主要優(yōu)點(diǎn)是所生成模型的臨床相關(guān)性。

使用數(shù)據(jù)庫

如果您無法訪問臨床成像樣本，有許多數(shù)據(jù)庫可供選擇，其中包含 DICOM 衍生的 STL。許多學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)都有自己的圖書館，并且存在提供許可協(xié)議的私人館藏。您可以在下面找到數(shù)據(jù)庫列表。

打印參數(shù)

3D生物打印中使用的每種材料都需要不同的設(shè)置，以獲得的擠出和干凈的線條。打印參數(shù)可以在微觀層面上影響結(jié)果，例如細(xì)胞活力，以及宏觀結(jié)果，例如孔徑和結(jié)構(gòu)保真度。下面我們將討論使用Allevi生物打印機(jī)進(jìn)行氣動(dòng)擠出生物打印工藝的關(guān)鍵參數(shù)。

切片參數(shù)

切片，或?qū)?STL 轉(zhuǎn)換為 G 代碼文件的過程，需要不同的設(shè)置，告訴軟件如何將 STL 劃分為多個(gè)層，以及打印機(jī)如何移動(dòng)以創(chuàng)建結(jié)構(gòu)。這些設(shè)置包括層高、噴嘴大小和打印速度。一般來說，層高與噴嘴尺寸密切相關(guān)，因?yàn)閲娮焱哂袌A形橫截面。需要注意的是，打印速度是指擠出機(jī)相對(duì)于打印表面的運(yùn)動(dòng)，而不是擠出材料的流速。材料屬性（如粘度）的變化會(huì)導(dǎo)致不同的材料在不同的設(shè)置下表現(xiàn)更好。例如，有些材料非常粘稠，擠出速度很慢，需要較慢的打印速度才能匹配。

需要注意的是，打印生物材料分辨率的限制因素是針頭的直徑。隨著層高的降低和打印速度的提高，分辨率通常也會(huì)提高。但是，噴嘴尺寸越大、層高越大、打印速度越慢，擠出就越容易。這些參數(shù)之間的平衡通常是打印優(yōu)化的主題，下面將對(duì)此進(jìn)行討論。選擇這些參數(shù)后，可以將 STL 切片為 G 代碼。

填充物是指印刷品特征表面或外殼內(nèi)的材料。在其他 3D 打印應(yīng)用中，填充通常由幾何形狀和占用體積百分比定義。Allevi 系統(tǒng)允許您在所選填充圖案中設(shè)置填充線之間的距離，從而更地控制終結(jié)構(gòu)。您需要填充物的形狀和數(shù)量將因構(gòu)建體的目的和您使用的細(xì)胞系而異。

打印機(jī)參數(shù)

準(zhǔn)備好 G 代碼后，您仍然需要為您的材料輸入正確的打印機(jī)設(shè)置。在 氣動(dòng)擠出平臺(tái)中，這些因素包括壓力、溫度和交聯(lián)。

隨著時(shí)間的流逝，我們已經(jīng)優(yōu)化了一些適用于一些常見生物材料的參數(shù)。這些通用打印參數(shù)非常適合剛開始使用新材料，并作為進(jìn)一步優(yōu)化的起點(diǎn)。

針

針頭特征（如規(guī)格、長(zhǎng)度、輪廓和材料）會(huì)顯著影響您可以使用的壓力、溫度和速度。雖然針頭的通常很明顯，但請(qǐng)使用我們的針頭選擇指南來權(quán)衡所有因素。

交聯(lián)

交聯(lián)是軟網(wǎng)絡(luò)分子改變其相互作用的過程，導(dǎo)致材料變硬。這可以通過下面進(jìn)一步討論的幾種機(jī)制來實(shí)現(xiàn)。采用可用于光交聯(lián)的 LED。用于熱交聯(lián)的加熱床板?；瘜W(xué)交聯(lián)也可以借助打印機(jī)配件（如培養(yǎng)皿和同軸打印噴嘴）進(jìn)行利用。

優(yōu)化

應(yīng)用各不相同，終結(jié)構(gòu)的目標(biāo)規(guī)格也各不相同。也許您追求速度和高吞吐量，或者您更專注于精細(xì)分辨率。無論哪種方式，優(yōu)化打印參數(shù)都是關(guān)鍵步驟。

基材

常見類型的打印基材

構(gòu)建表面有三種基本類型：載玻片、培養(yǎng)皿和孔板。載玻片可用于將構(gòu)建體移動(dòng)到顯微鏡上進(jìn)行成像。培養(yǎng)皿提供了一個(gè)非常簡(jiǎn)單的構(gòu)建環(huán)境，適合大型構(gòu)建和測(cè)試?？装鍨闄z測(cè)提供方便的分選。每種類型的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)部件配合使用。事實(shí)上，Allevi 1 和 Allevi 3 平臺(tái)中的自動(dòng)校準(zhǔn)功能經(jīng)過編程，可以補(bǔ)償制造商的支撐構(gòu)建表面深度，從而確保的校準(zhǔn)和打印體驗(yàn)。

弓形和曲率

一些建筑表面在其底部表現(xiàn)出彎曲或凸拱。這可能會(huì)給擠出生物打印帶來問題，因?yàn)椴牧铣练e是分層發(fā)生的。如果構(gòu)建表面的一個(gè)點(diǎn)高于另一個(gè)點(diǎn)，則存在低通或高通不沉積的風(fēng)險(xiǎn)。

玻璃與塑料

雖然大多數(shù)培養(yǎng)皿和孔板都是塑料的，但玻璃是一種可以帶來好處的替代品。玻璃具有更高的耐溫性和耐化學(xué)性，而某些塑料可能會(huì)與某些生物墨水中使用的有機(jī)溶劑發(fā)生反應(yīng)。玻璃的彎曲程度也較低。然而，在相同的尺寸下，玻璃更重、更昂貴。此外，碎玻璃會(huì)造成危險(xiǎn)。您可以在其中任何一個(gè)上涂上細(xì)胞友好型涂層。對(duì)于某些粘性物質(zhì)的打印，兩者都可能過于光滑而無法沉積。在這種情況下，您可以使用不同的打印表面來增加表面的摩擦力。

基材剛度

細(xì)胞在仿生環(huán)境中存活得好。因此，細(xì)胞環(huán)境的幾何形狀和應(yīng)力分布會(huì)影響細(xì)胞活力和分化。為了從您的細(xì)胞中獲得良好結(jié)果，在構(gòu)建表面引入額外的結(jié)構(gòu)可能會(huì)有所幫助，以改變普通載玻片、板或培養(yǎng)皿的條件。

加熱/冷卻

組織工程中常使用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞受益于保持在接近哺乳動(dòng)物體溫的溫度范圍內(nèi)。為了幫助重現(xiàn)這種效果，Allevi 3 系統(tǒng)有一個(gè)加熱床板，可以升高到高達(dá) 60°C 的溫度。 這對(duì)于較長(zhǎng)的打印件特別有用。

有些材料對(duì)溫度非常敏感，結(jié)構(gòu)的機(jī)械性能可能會(huì)受到構(gòu)建環(huán)境中保持的溫度的影響。對(duì)于某些材料，如膠原蛋白，在溫度受控（冷）的房間中進(jìn)行打印可能會(huì)有所幫助。對(duì)于其他材料，建筑表面的不同溫度可能足以引起熱交聯(lián)，從而增加建筑的結(jié)構(gòu)完整性。

3D生物打印是3D打印在活細(xì)胞、生物分子和生物材料圖案化中的應(yīng)用。它允許對(duì)細(xì)胞環(huán)境變量進(jìn)行微觀控制，并對(duì)結(jié)構(gòu)幾何形狀進(jìn)行宏觀控制。這很重要，因?yàn)槿梭w中的細(xì)胞在三維的環(huán)境中發(fā)揮作用。重新創(chuàng)造這種環(huán)境使人們能夠使用更具生理相關(guān)性的活組織模型。本文概述了經(jīng)驗(yàn)豐富的研究人員用于進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并為他們的進(jìn)一步研究提供信息的基本知識(shí)，重點(diǎn)是基于微擠出的 3D 生物打印。

選擇細(xì)胞類型

要使用的細(xì)胞類型或細(xì)胞系將決定打印過程其余部分的許多限制。一些組織，如皮膚和肌腱，已經(jīng)相當(dāng)容易地生長(zhǎng)成堅(jiān)固的結(jié)構(gòu)。其他的，如神經(jīng)組織，可能很難處理。在細(xì)胞系的臨床相關(guān)性和易用性之間取得平衡非常重要。您可能還需要考慮細(xì)胞的成熟度和來源。您的研究是否需要人類和非人類細(xì)胞之間的明確對(duì)比？您是否需要確保某種類型的人體組織在您的結(jié)構(gòu)中工作？您是要打印一個(gè)模型生物系統(tǒng)，該模型系統(tǒng)需要發(fā)育的組織，還是需要證明您的工作可以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化？

或者，您選擇的細(xì)胞系可能取決于您使用的墨水。例如，您可能有一種非常厚的新型墨水，需要相對(duì)較高的力才能擠出。像神經(jīng)細(xì)胞這樣的脆弱細(xì)胞對(duì)于這種墨水的實(shí)驗(yàn)來說可能是一個(gè)糟糕的選擇。

細(xì)胞培養(yǎng)是在受控的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中培養(yǎng)細(xì)胞的過程。這是3D生物打印的一個(gè)重要方面，因?yàn)樯锎蛴⊙芯啃枰S多細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)通常從從相關(guān)細(xì)胞系購買細(xì)胞開始。

一旦您為您的目標(biāo)選擇了合適的細(xì)胞，您可能需要將您購買的樣品培養(yǎng)成足夠大的批量，以便在生物打印實(shí)驗(yàn)中使用。 對(duì)于載有細(xì)胞的生物墨水，細(xì)胞濃度范圍為每毫升生物墨水 1-10 萬個(gè)細(xì)胞。單個(gè)生物打印實(shí)驗(yàn)很容易需要 50 萬個(gè)細(xì)胞。 在我們的指南中閱讀更多關(guān)于細(xì)胞密度的信息 選擇正確的細(xì)胞數(shù)量.

要為生物打印選擇合適的細(xì)胞密度，您先需要考慮您的應(yīng)用和您想要進(jìn)行的終檢測(cè)。本文將幫助您確定生物墨水的細(xì)胞密度。

體內(nèi)細(xì)胞密度

身體的每個(gè)器官都有特定的細(xì)胞密度，但準(zhǔn)確估計(jì)這個(gè)值并不容易?；诿庖呒?xì)胞化學(xué)、DNA含量測(cè)量或數(shù)學(xué)計(jì)算有不同的方法[1]。例如，肝臟估計(jì)含有 1.3×1081克組織中的細(xì)胞[2]。這與體外細(xì)胞培養(yǎng)的平均細(xì)胞密度（約1×10）截然不同 5細(xì)胞/cm2更重要的是，組織密度是動(dòng)態(tài)的，在生物體的發(fā)育過程中以及致病過程中可能會(huì)發(fā)生變化。

體外細(xì)胞密度

初接種在給定體外系統(tǒng)中的細(xì)胞數(shù)量會(huì)對(duì)培養(yǎng)結(jié)果產(chǎn)生重大影響?；虮磉_(dá)、分化、增殖和細(xì)胞凋亡的密度依賴性調(diào)控是該方程式中的關(guān)鍵要素。具體參數(shù)將因細(xì)胞類型而異。 例如，已知癌細(xì)胞缺乏接觸抑制機(jī)制，使它們能夠以相對(duì)較高的密度生長(zhǎng)而不會(huì)減少增殖[4,5]。細(xì)胞培養(yǎng)物的密度也會(huì)影響藥物的積累，導(dǎo)致對(duì)測(cè)試化合物的不同反應(yīng)[6]。鑒于所有這些事實(shí)，應(yīng)優(yōu)化和選擇細(xì)胞密度，以在功能和生理上模仿天然組織。

生物學(xué)考慮

先，問自己以下問題：

• 您試圖模仿的組織天然成分是什么？

• 您正在使用的細(xì)胞是增殖還是有絲分裂后？

• 您打算將構(gòu)建體在細(xì)胞培養(yǎng)物中保留多長(zhǎng)時(shí)間？

由于缺乏細(xì)胞間相互作用或生長(zhǎng)因子分泌有限，因此細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)刺激不足，初始細(xì)胞數(shù)量過低可能會(huì)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。如果構(gòu)建體被設(shè)計(jì)為在體內(nèi)移植，細(xì)胞數(shù)量也是一個(gè)重要參數(shù)。生物墨水中沒有足夠的細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致與宿主組織的整合不良[8]。

另一方面，從過多的細(xì)胞開始會(huì)導(dǎo)致增殖的快速接觸抑制、細(xì)胞簇的過度生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致缺氧條件的發(fā)展、營(yíng)養(yǎng)流動(dòng)受限或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗迅速，并產(chǎn)生大量廢物堆積。后一個(gè)考慮因素尤為重要，因?yàn)橥ǔＳ糜?2D 培養(yǎng)的培養(yǎng)基體積不足以支持高密度 3D 細(xì)胞構(gòu)建體的生長(zhǎng)。因此，如果培養(yǎng)基中含有酚紅，并且觀察到培養(yǎng)基顏色的快速變化，則可能表明應(yīng)增加培養(yǎng)基體積，或更頻繁地更換培養(yǎng)基[7,8]。高細(xì)胞濃度還可以對(duì)ECM產(chǎn)生、水凝膠重塑和為細(xì)胞創(chuàng)造合適的環(huán)境產(chǎn)生積極影響[9]。

機(jī)械注意事項(xiàng)

將細(xì)胞成分添加到您的生物材料中會(huì)改變其特性。高細(xì)胞密度會(huì)增加懸浮細(xì)胞的水凝膠的粘度[7]。更高粘度的生物墨水需要增加分配壓力，這可能會(huì)對(duì)細(xì)胞活力產(chǎn)生負(fù)面影響[然而，這可以通過更大的噴嘴直徑來補(bǔ)償]。高細(xì)胞含量也會(huì)降低水凝膠硬度[9]。這些因素將影響沉積鏈的幾何形狀及其機(jī)械強(qiáng)度，因此，如果需要高分辨率和長(zhǎng)期維護(hù)結(jié)構(gòu)，則應(yīng)根據(jù)生物墨水的細(xì)胞密度優(yōu)化打印參數(shù)[10]。

細(xì)胞數(shù)量?jī)?yōu)化

為了優(yōu)化應(yīng)用的細(xì)胞數(shù)量，您應(yīng)該從一系列不同的密度開始。您可以在下表 1 中找到一些 Allevi 作者在其出版物中使用的單元格編號(hào)。如果您打算使用類似的細(xì)胞和生物材料組合，這是一個(gè)很好的起點(diǎn)。

為獲得終結(jié)果，請(qǐng)進(jìn)行簡(jiǎn)單的生物相容性研究，包括生物墨水中幾種濃度的細(xì)胞。先研究初始和終點(diǎn)細(xì)胞的活力和增殖。稍后，您可以更詳細(xì)地檢查功能結(jié)果。這將取決于您的實(shí)驗(yàn)，但請(qǐng)考慮終目標(biāo)以及您的構(gòu)建體應(yīng)該反映什么：正確的藥物反應(yīng)、遵循體內(nèi)發(fā)育或表達(dá)一些所需的標(biāo)記物。對(duì)于終的生物打印，請(qǐng)記住調(diào)整打印條件以保持高細(xì)胞活力和分辨率。