角膜炎，也被稱為角膜潰瘍，是一種常見的角膜疾病，由細(xì)菌、真菌、病毒或變形蟲引起。這種眼部疾病是導(dǎo)致視力喪失的主要原因，據(jù)報(bào)道，傳染性角膜炎已成為第五大致盲原因。長期佩戴隱形眼鏡是導(dǎo)致了金黃色葡萄菌的侵入的主要誘因之一，這種細(xì)菌的侵入容易誘發(fā)細(xì)菌性角膜炎，其臨床癥狀為急性疼痛、紅腫、畏光。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌感染可誘導(dǎo)感染組織微環(huán)境發(fā)生酸性變化，進(jìn)一步加劇疾病發(fā)病機(jī)制。傳統(tǒng)上，細(xì)菌性角膜炎最常見的治療方法是在眼表面局部使用廣譜抗生素滴眼液來對(duì)抗傳染性細(xì)菌。然而，由于角膜上皮屏障阻止親水藥物大分子穿透角膜，以及淚膜稀釋清除藥物溶液，大大降低了生物利用度和減少了藥物滯留時(shí)間。因此，為了維持角膜內(nèi)有足夠的藥物濃度，通常需要使用大量抗生素和頻繁給藥，這很可能給眼組織帶來毒性影響，增加抗菌素耐藥性的風(fēng)險(xiǎn)。

基于此，武漢大學(xué)藥學(xué)院黎威教授團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)開發(fā)了一種自植入的核殼結(jié)構(gòu)微針貼片，用于治療細(xì)菌性角膜炎。相關(guān)研究成果以“Self-Implantable Core–Shell Microneedle Patch for Long-Acting Treatment of Keratitis via Programmed Drug Release"為題發(fā)表在期刊《Small》上。武漢大學(xué)藥學(xué)院博士研究生江雪為第一作者，武漢大學(xué)藥學(xué)院黎威教授為通訊作者。

該微針貼片是利用摩方精密microArch® S240（精度：10μm）3D打印設(shè)備加工模具后經(jīng)PDMS翻模制備而成。該研究首先通過原位的還原法制備了裝載納米銀的沸石咪唑酯框架-8納米粒（Ag@ZIF-8），然后將其裝載在聚乙烯醇（PVA）組成的微針?biāo)苄院诵牟糠?。MNs的外殼結(jié)構(gòu)由生物相容性和可生物降解的天然蛋白質(zhì)絲素蛋白(SF)組成，作為抗血管生成/抗炎藥物雷帕霉素的(Rapamycin, Rapa)的緩釋藥物庫（圖1）。

圖1 裝載Ag@ZIF-8和雷帕霉素的核殼微針的示意圖

隨后通過透射電鏡，x射線光電子能譜儀等多種表征證明，當(dāng)納米銀被成功包覆在ZIF-8中，仍然可以維持ZIF-8原來的晶體結(jié)構(gòu)。氮?dú)馕椒ê蜔嶂胤治鲎C實(shí)納米銀的負(fù)載率約為15%。在不同PH下做釋放發(fā)現(xiàn)，Zn2+和Ag+在酸性pH下大量釋放，呈現(xiàn)較靈敏的酸響應(yīng)。并且通過透射電鏡觀察得到ZIF-8的結(jié)構(gòu)在酸性條件下幾乎都破壞了（圖2）。

圖2. Ag@ZIF-8 NPs的表征。A) a) ZIF-8 NPs和b) Ag@ZIF-8 NPs在水溶液中的照片。比例尺，1厘米。TEM照片c) ZIF-8 NPs和d) Ag@ZIF-8 NPs在甲醇中的分布。比例尺為100納米。B) Ag@ZIF-8 NPs的XPS測(cè)量譜。C) ZIF-8 NPs和Ag@ZIF-8 NPs的粒度分布。D) ZIF-8 NPs和Ag@ZIF-8 NPs的紫外光譜。E) ZIF-8 NPs和Ag@ZIF-8的XRD譜圖。F) ZIF-8 NPs和Ag@ZIF-8 NPs的N2吸附-解吸等溫線。G) ZIF-8 NPs和Ag@ZIF-8 NPs的TGA曲線。H) Ag@ZIF-8 NPs中Zn2+和Ag+在不同pH值介質(zhì)中的釋放分布。每個(gè)點(diǎn)代表平均值±SD (n = 3)。I)Ag@ZIF-8在不同pH值的培養(yǎng)基中孵育12小時(shí)后的TEM照片。比例尺為200 nm。

然后，通過SEM觀察微針的結(jié)構(gòu)。該微針為4×4的方形矩陣，針體呈圓錐形，底部直徑為400 μm，高度為850 μm。殼層絲素蛋白用羅丹明標(biāo)記，核層用FITC標(biāo)記，在共聚焦顯微鏡下可明顯觀察到紅色熒光包裹綠色熒光。同時(shí)通過元素映射分析針尖的橫截面，可以觀察到殼層擁有豐富的氮元素，而殼層包圍的核心層富集較多的Zn元素，證實(shí)了微針的殼核結(jié)構(gòu)。通過穿刺明膠凝膠塊，可以觀察到FITC標(biāo)記的PVA層進(jìn)入凝膠后立即向上擴(kuò)散，而紅色標(biāo)記的SF層保持不變（圖3）。

圖3. 核殼MN貼片的表征。A)制備的核殼MN貼片、單個(gè)MN、針尖和針底的SEM圖像。比例尺從左到右分別代表400 μm、400 μm、20 μm、20 μm。B)用不同熒光標(biāo)記核-殼MN的亮場(chǎng)和熒光圖像，殼標(biāo)記為紅色，核標(biāo)記為綠色。比例尺，500 μm。C)核殼MN在不同深度的橫截面圖。標(biāo)尺，50 μm。D)核-殼MN的EDS元素映射分析。標(biāo)尺，20 μm。E)明膠水凝膠中核殼MNs的快速分離。比例尺，500 μm。黃色箭頭表示綠色熒光標(biāo)記的NPs從MNs核心快速釋放，藍(lán)色虛線表示空氣和水凝膠之間的界面。

緊接著，通過力學(xué)測(cè)試和體外眼球上穿刺，證實(shí)了該殼核微針具有較好的力學(xué)性能和較高的穿刺效率。核心層進(jìn)入眼球后，立即擴(kuò)散，而殼層保持不變。微針的藥物釋放曲線同樣證實(shí)了核心層的速釋和殼層的緩釋（圖4）。這種殼層結(jié)構(gòu)可以用來保護(hù)核心層，使抗菌納米粒較多的遞送到角膜基質(zhì)，而不是溶解在角膜表層。

圖4. 體外和離體核殼MN貼片角膜植入和藥物釋放動(dòng)力學(xué)。A)核殼MNs的力學(xué)試驗(yàn)。B)核殼MNs貼片在離體大鼠角膜上的應(yīng)用。比例尺，500 μm。C) ZIF-8 NPs和D) Rapa的體外釋放行為。E)離體角膜植入前后核殼MN貼片的亮場(chǎng)圖像。比例尺，500 μm。

最后通過在角膜基質(zhì)內(nèi)注射金黃色葡萄球菌，實(shí)現(xiàn)在大鼠上造細(xì)菌性角膜炎模型，然后通過鏡下觀察眼球，提取角膜細(xì)菌，角膜炎臨床評(píng)分和病理切片來評(píng)估殼核微針的治療效果（圖5）。相比于其他組，殼核微針不僅在較短時(shí)間（5天）內(nèi)殺死了細(xì)菌，抑制了角膜炎癥，并且減少了角膜新生血管的發(fā)生，這得益于殼核微針較高的遞藥效率和雷帕霉素的長效緩釋能力。我們還發(fā)現(xiàn)空白MNs在老鼠觀察期間沒有造成任何損傷，也沒有加重角膜炎的發(fā)展，證明了MNs的安全性。

圖5. 核殼MNs貼片治療細(xì)菌性角膜炎的療效觀察。A)處理過程示意圖。B)角膜炎大鼠經(jīng)Ag@ZIF-8滴劑、Ag@ZIF-8與Rapa滴劑混合、空白MNs、Ag@ZIF-8治療后的眼球照片原子核-殼層原子。以健康大鼠眼為陽性對(duì)照，未處理的模型大鼠眼為陽性對(duì)照。綠色箭頭表示角膜中生成的血管。比例尺，2mm(上)和400 μm(下)。C)第5天各組大鼠角膜提取的細(xì)菌涂板。比例尺，2.5厘米。D)各組細(xì)菌菌落的定量。E)臨床各組大鼠的角膜炎得分。F)各組大鼠角膜H&E染色。標(biāo)尺, 200 μm。

結(jié)論：在這項(xiàng)工作中，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種具有核-殼結(jié)構(gòu)的眼部微針貼片，用于協(xié)同治療細(xì)菌性角膜炎。這種微針貼片含有pH響應(yīng)性Ag@ZIF-8 NPs和抗炎抗血管生成的藥物(即Rapa)。在角膜植入后，由于淚液快速溶解可溶層，核殼MNs可以迅速從貼片背襯中分離并嵌入角膜。MNs植入后，Ag@ZIF-8 NPs從核心層擴(kuò)散，隨后在感染角膜的酸性環(huán)境中發(fā)生響應(yīng)性降解，通過釋放金屬離子(Zn2+、Ag+)發(fā)揮抗菌活性，促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞遷移。同時(shí)，由天然材料(即SF)組成的可降解外殼使Rapa緩慢釋放，從而實(shí)現(xiàn)長效抗炎和抗角膜血管生成。由于有益的程序性藥物釋放特性，單次給藥核殼微針貼片在細(xì)菌性角膜炎大鼠模型中實(shí)現(xiàn)了*的協(xié)同抗菌、血管抑制和抗炎效果，為細(xì)菌性角膜炎的治療提供了一種有前景的方法。