一、  實驗目的

1)  了解并掌握光學顯微鏡的操作方法和觀察技巧

2)  學會細菌及真菌觀察鑒定的一系列實驗方法及其原理

二、實驗器材

1.試劑及藥品：

結(jié)晶紫染液、 95%乙醇、番紅染液、 5%孔雀綠水溶液、甘油、 1 mol/L NaOH 溶液  、 1 mol/L 

HCl 溶液、盧戈式碘液、溴甲酚紫指示劑、甲基紅指示劑、吲哚試劑、NaCl、1.6%花生油中

性紅水溶液、1.6%溴甲酚紫乙醇溶液、滅菌水等。

2.器材： 

三角瓶、試管、燒杯、培養(yǎng)皿、接種環(huán)、接種針、載玻片、蓋玻片、酒精燈、涂布棒、顯微鏡、電子天平、藥匙、玻璃棒、稱量紙、量筒、加熱爐、PH 試紙、高壓蒸汽滅菌鍋、棉花、紗布、牛皮紙、麻繩、恒溫箱、試管架、剪刀、鑷子、解剖刀、U 形管、移液管等。

3.樣品：

校園內(nèi)草地深層土壤（深度 20cm）

三、實驗原理

1.細菌簡單染色

利用單一染料對菌體進行染色的方法叫做簡單染色。

2.細菌的革蘭氏染色

經(jīng)此法染色后，細胞保留初染劑藍紫色的細菌為革蘭氏陽性菌；細胞中初染劑被脫色劑洗脫而染上復染劑的顏色（紅色）的細菌為革蘭氏陰性菌。

3.細菌芽孢染色

首先用著色能力較強的染料，如孔雀綠（malachite green）或堿性品紅（basicfuchsin）在加熱條件下進行染色時，此染料不僅可以進入菌體，而且也可以進入芽孢，進入菌體的染料可經(jīng)水洗脫色，而進入芽孢的染料則難以透出。再用對比度大的復染劑（如番紅液）染色后，菌體染上復染劑顏色，而芽孢仍為原來的顏色，這樣就可以將兩者區(qū)別開來。

4.細菌的生理生化實驗

糖發(fā)酵試驗是常用的鑒別微生物的生化反應(yīng)

甲基紅試驗是用來檢測由葡萄糖產(chǎn)生的有機酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。

5.真菌的觀察及鑒定

將培養(yǎng)物直接置于顯微鏡下可觀察到霉菌自然生長狀態(tài)并可連續(xù)觀察不同時期發(fā)育期的菌體結(jié)構(gòu)特征的變化。

四、實驗步驟

4.1 土壤菌群分離

4.1.1 滅菌準備

配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和 PDA 培養(yǎng)基，分別裝入三角瓶中，封好。將內(nèi)裝 90ml 的蒸餾水和玻璃珠若干的三角瓶、已配好的培養(yǎng)基、涂布棒、移液管六支、試管（內(nèi)裝 9ml 蒸餾水）六支、平皿若干放入滅菌鍋中滅菌。

4.1.2 梯度稀釋

稱取土壤樣品 10g 加入 90ml 滅菌水中振蕩，直至土壤大顆粒被*打碎，然后靜置 30 分鐘以上，使其澄清。實驗時要保持無菌操作，防止雜菌污染土壤菌液。梯度稀釋是將原液按照十倍的等級進行稀釋，在無菌的條件下，用移液管一取 1ml 上清液加入裝有 9ml 滅菌水試管中振蕩，將其稀釋為 10-1倍，用不同的移液管依次從已稀釋的菌液中取液，將菌液梯度稀釋為原液的 10-1、10-2、10-3、10-410-5

倍，分別為-1、-2、-3、-4、-5 梯度，分別表示稀釋原液用 0表示。

4.1.3 涂布平板

將冷卻至 50-55℃的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和 PDA 培養(yǎng)基倒平板，平板固定后進行涂布。在無菌條件下，用對應(yīng)編號的移液管取菌液加到平板中，然后用涂布棒將其在平板鋪勻。細菌培養(yǎng)基對 0、 -2、 -4、 -5 梯度進行涂布，霉菌培養(yǎng)基對 0、 -3 梯度進行涂布。每梯度涂 3 個平板。

4.1.4 恒溫培養(yǎng)

將霉菌培養(yǎng)基放入 27℃恒溫箱中培養(yǎng) 3 天，將細菌培養(yǎng)基平板置于 37℃恒溫培養(yǎng) 24 小時。

4.1.5 菌落統(tǒng)計

對不同梯度的平板進行觀察，選擇合適梯度進行菌落計數(shù)，一般每平板 30 個為宜。此次試驗中，細菌培養(yǎng)基上-4 梯度為*佳。霉菌培養(yǎng)基中-3 梯度為*佳。在細菌培養(yǎng)基中，根據(jù)菌落形態(tài)的不同選取 5 種菌，考慮到可能有的菌相同，本組選取了6 種菌，對其進行觀察，描述菌落形態(tài)。選擇三種霉菌，對其編號。

4.1.6 畫線分離

配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和 PDA 培養(yǎng)基，滅菌（滅菌鍋：山東興華）后倒取平板，將選出的菌進行劃線分離，考慮到菌數(shù)多，平板不足，每種菌只劃兩個平板。劃好后分別放入相應(yīng)恒溫箱中培養(yǎng)。

4.2 細菌的純化及鑒定

4.2.1 細菌純化及保藏

配制培養(yǎng)基，在不同菌劃線的培養(yǎng)基中挑取單個菌落進行再次劃線，直至菌種*純化。

制備試管斜面，將菌劃斜面培養(yǎng)留種。 

4.2.2 細菌形態(tài)觀察

對各菌進行制片，進行單染色觀察其形態(tài)

4.2.3 革蘭氏染色

為鑒定細菌的革蘭氏反應(yīng)對菌進行革蘭氏染色，染色前先將進行標準株培養(yǎng)，標準株為大腸桿菌（革蘭氏陰性菌）、金黃色葡萄球菌（革蘭氏陽性菌），將標準株與純化的八株菌進行培養(yǎng) 12-18 小時，這樣無芽孢的產(chǎn)生，可以防止其影響染色結(jié)果。染色完成后進行鏡檢。

4.2.4 穿刺實驗

穿刺實驗是對菌是否有鞭毛進行鑒定的十分有效的方法。

配制細菌穿刺培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基與細菌培養(yǎng)基大體相同，將其中的瓊脂減少的原來的一半

即為半固體穿刺培養(yǎng)基。

（1）將培養(yǎng)基配好后加熱(微波爐)，使其*融化，略微冷卻后倒入試管中，密封后滅菌。

（2）冷卻固定后，在無菌（超凈工作臺：內(nèi)循環(huán)風，蘇凈安泰）操作下，用接種針將各菌穿刺接種到半固體培養(yǎng)基中，穿刺時

盡量要直，避免劃壞培養(yǎng)基。

（3）將接種好的穿刺培養(yǎng)基放入 37℃的恒溫箱中培養(yǎng) 24 小時。

4.2.5 細菌芽孢染色

1)  制片

按常規(guī)涂片、干燥、固定。

2)  染色

加數(shù)滴 5%孔雀綠染液于涂片上，用木夾夾住載玻片一端，在微火（普通酒精燈）上加熱至染料冒蒸汽并開始計時。維持 5min。加熱過程中及時補充染液。切勿讓涂片干涸。

3)  水洗

待玻片冷卻后，用緩流自來水沖洗載玻片背面，直至流出的水無色為止。 

4)  復染

用 0.5%番紅染液復染 1.5min 。 

5)  水洗

用緩流水洗后，干燥。

6)  鏡檢（普通光學顯微鏡）

先低倍鏡，再高倍鏡，后油鏡觀察。

4.2.6 生理生化試驗

（1）配制培養(yǎng)基

分別配制淀粉培養(yǎng)基、油脂培養(yǎng)基，配制好后放入三角瓶中準備滅菌。配制葡萄糖和乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基，裝入試管，將其中的德漢氏小管灌滿放入試管。配制蛋白胨水培養(yǎng)基和葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，配制好后加入試管中，每支試管 1/3 體積培養(yǎng)基，準備滅菌。

（2）接種準備

將培養(yǎng)基貼上標簽包好后放到高壓蒸汽滅菌鍋中，在 121℃滅菌 20 分鐘。滅完菌取出后冷卻，將淀粉培養(yǎng)基、油脂培養(yǎng)基倒平板。 

（3）接種

①在淀粉培養(yǎng)基、油脂培養(yǎng)基平板背面用標簽筆畫一個十字，將其分為相等的四個區(qū)域，再在相應(yīng)的位置寫上要種的菌種的編號，在無菌條件下，將菌種分別接在相應(yīng)的區(qū)域，對于淀粉培養(yǎng)基，在接種時，采取觸點接種，對于脂肪培養(yǎng)基，采取畫十字接種,貼上標簽。

②在無菌條件下，將各菌種分別接在糖發(fā)酵培養(yǎng)基液中，每種菌在葡萄糖和乳糖培養(yǎng)基中各接兩支培養(yǎng)基，每種留一支作為對照，貼上標簽。

③在無菌條件下，將各菌分別接種在蛋白胨水培養(yǎng)基和葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，每種菌分別在蛋白胨水培養(yǎng)基和葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中接兩支培養(yǎng)基試管，貼上標簽。

（4）培養(yǎng)

將接種好的培養(yǎng)基放到 37 攝氏度的恒溫箱中培養(yǎng) 48 小時。

（5）實驗觀察

4.2.7 確定菌屬

在根據(jù)以上實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，查詢伯杰氏手冊，確定菌的屬。

4.3 霉菌的純化及鑒定

4.3.1 霉菌純化

配制 PDA 培養(yǎng)基，將霉菌再次劃線，直至菌種*純化。

4.3.2 霉菌形態(tài)觀察

（1）營養(yǎng)小室及其他滅菌準備

（2）制備營養(yǎng)小室

（3）接種

（4）放置 27℃恒溫箱中培養(yǎng)三天

（5）培養(yǎng)三天后，將營養(yǎng)小室從恒溫箱中取出，用顯微鏡觀察霉菌形態(tài)。

4.3.4 霉菌鑒定

根據(jù)觀察結(jié)果，查詢相應(yīng)的霉菌圖譜，確定分離出的霉菌的類別。