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產(chǎn)品簡介
RIPA裂解液（中）：對于培養(yǎng)瓶中的貼壁細胞，推薦先使用常規(guī)方法消化細胞，再參考懸浮細胞蛋白提 取步驟操作。
詳細介紹
| RIPA裂解液（中） | ||||||||
| RIPA Lysis Buffer | ||||||||
| Cat No:DY7020 | ||||||||
| Size:100ml | ||||||||
| 產(chǎn)品組分 | ||||||||
| 組分 Contents | LY7020 | |||||||
| RIPA裂解液 | 100ml | |||||||
| 儲運條件 | ||||||||
| 4℃保存。 | ||||||||
| 說 明 | ||||||||
| 本產(chǎn)品僅供科研使用，請勿用于臨床診斷及其他用途。 | ||||||||
| 產(chǎn)品簡介 | ||||||||
| RIPA裂解液是一種傳統(tǒng)的組織以及細胞快速裂解液，主要用于從動物組織和哺乳動物細胞中抽取可溶性蛋白，可用于裂解貼壁細胞和懸浮細胞。按照其裂解液的強度可以分為強、中、弱三類，具體特點和差異請參考附表2，可根據(jù)實驗需求選擇相應產(chǎn)品。經(jīng)RIPA裂解液提取的蛋白可應用于蛋白定量、Western Blot、IP等檢測分析。 RIPA裂解液的主要成分為50mM Tris(pH 7.4)，150mM NaCl，1% NP-40，0.5% sodium deoxycholate，0.1% SDS，以及sodium orthovanadate，sodium fluoride，EDTA，leupeptin等多種抑制劑，可以有效抑制蛋白降解。 | ||||||||
| 實驗前準備及注意事項 | ||||||||
| 1．為防止蛋白降解，所有的操作盡量在冰上進行。 | ||||||||
| 2．使用RIPA裂解液得到的蛋白樣品，可采用BCA法進行蛋白定量，以測定蛋白濃度。產(chǎn)品可單獨向本公司訂購，如：LY7052 BCA蛋白定量試劑盒。本品含有高濃度的去垢劑，不能用Bradford法進行蛋白定量。 | ||||||||
| 3．建議在使用RIPA裂解液前，向溶液中加入蛋白酶抑制劑或磷酸酶抑制劑，以防止蛋白降解，或保持蛋白的磷酸化狀態(tài)。產(chǎn)品可單獨向本公司訂購，如：LY7150 蛋白酶抑制劑混合物，LY7151 磷酸酶抑制劑混合物。 | ||||||||
| 4．若需獲得更高濃度的蛋白，應減少哺乳動物蛋白抽提試劑的使用量。 | ||||||||
| 5． 對于培養(yǎng)瓶中的貼壁細胞，推薦先使用常規(guī)方法消化細胞，再參考懸浮細胞蛋白提 取步驟操作。 | ||||||||
| 6．對于離心獲得的細胞，若不確定細胞體積，可根據(jù)細胞數(shù)量計算RIPA裂解液的使用量。如5×106個Hela細胞約需加入500 μl RIPA裂解液，以此類推。 | ||||||||
| 操作步驟 | ||||||||
| 一、細胞樣品 貼壁細胞蛋白抽提 | ||||||||
| 1．小心傾去貼壁細胞的培養(yǎng)液。 | ||||||||
| 2．可選步驟：若培養(yǎng)基中含有酚紅或其他可能影響實驗結果的物質(zhì)，請先使用預冷的 PBS漂洗細胞。 | ||||||||
| 3．加入適量RIPA裂解液（使用前2-3min內(nèi)加入蛋白酶抑制劑），試劑使用量請參考附表1，在冰上用槍頭吹打貼壁細胞。 | ||||||||
| 表 1 貼壁細胞 RIPA 裂解液使用量推薦表 | ||||||||
| 細胞培養(yǎng)板類型或培養(yǎng)面積 | 裂解液使用量 | |||||||
| 100 mm * | 500-1,000 µl | |||||||
| 60 mm | 250-500 µl | |||||||
| 6 孔培養(yǎng)板 | 200-400 µl /孔 | |||||||
| 24 孔培養(yǎng)板 | 100-200 µl /孔 | |||||||
| 96 孔培養(yǎng)板 | 50-100 µ l /孔 | |||||||
| * 對于100 mm培養(yǎng)板培養(yǎng)的107個細胞 (50 mg)可裂解獲得約3 mg總蛋白（細胞類型不同略有差異）。 | ||||||||
| 4．將裂解液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，冰上孵育20min，使細胞充分裂解。 | ||||||||
| 5．14,000×g離心10min。轉(zhuǎn)移上清液至新管中，進行下一步分析。 | ||||||||
| 懸浮細胞蛋白提取 | ||||||||
| 1．懸浮細胞2,500×g，離心5min，棄去上清。 | ||||||||
| 2．可選步驟：若培養(yǎng)基中含有酚紅或其他可能影響實驗結果的物質(zhì)，請使用PBS漂洗 細胞。漂洗后的細胞懸浮液2,500×g離心5min，棄去上清。 | ||||||||
| 3．加入適量RIPA裂解液（使用前2-3min內(nèi)加入蛋白酶抑制劑），每5×106 細胞加入約200-500 µl RIPA裂解液，吹打均勻。 | ||||||||
| 4．冰上放置20min，使細胞充分裂解。 | ||||||||
| 5．14,000×g離心10min。轉(zhuǎn)移上清液至新管中，進行下一步分析。 | ||||||||
| 二、組織樣品 | ||||||||
| 1．取適當?shù)腞IPA裂解液，在使用前2-3min內(nèi)加入蛋白酶抑制劑。 | ||||||||
| 2．稱量實驗組織的重量，按照1：10（g/ml）的比例加入RIPA裂解液后將組織剪成細小碎片，用電動勻漿器勻漿處理。若需要濃縮的蛋白提取物，可適當減少組織蛋白抽提試劑使用量。 | ||||||||
| 3．冰上孵育20min，使細胞充分裂解。 | ||||||||
| 4．14,000×g 離心10min。轉(zhuǎn)移上清液至新管中，進行下一步分析。 | ||||||||
| 注：RIPA裂解液的裂解產(chǎn)物中可能會出現(xiàn)一小團透明膠狀物，屬正?，F(xiàn)象。該透明膠狀物為基因組。 | ||||||||
| 表2 蛋白裂解液性能、參數(shù)比較 | |||||||
| 目錄號 | LY7001 | LY7020 | LY7021 | ||||
| 產(chǎn)品名稱 | RIPA裂解液（強） | RIPA裂解液（中） | RIPA裂解液（弱） | ||||
| 有效裂解成分 | 1%Triton X-100， 1% sodium deoxycholate， 0.1% SDS | 1% NP-40， 0.5% sodium deoxycholate， 0.1% SDS | 1% NP-40， 0.25% sodium deoxycholate | ||||
| 裂解強度 | 強 | 中 | 溫和 | ||||
| 膜蛋白提取 | 很好 | 較好 | 一般 | ||||
| 胞漿蛋白提取 | 很好 | 很好 | 很好 | ||||
| 核蛋白提取 | 很好 | 較好 | 較好 | ||||
| 主要用途 | WB，IP | WB，IP | WB，IP，CO-IP | ||||