一、微生物純培養(yǎng)技術(shù)
微生物在自然界中不僅分布廣，而且種類(lèi)多，并多是混雜地生活在一起。要想研究或利用某一微生物，必須把混雜的微生物類(lèi)群分離開(kāi)來(lái)，以得到只含一種微生物的純培養(yǎng)。微生物學(xué)中將在實(shí)驗(yàn)室條件下由一個(gè)細(xì)胞或一種細(xì)胞群繁殖得到的后代稱(chēng)為微生物的純培養(yǎng)。
純培養(yǎng)技術(shù)包括兩個(gè)基本步驟：① 從自然環(huán)境中分離培養(yǎng)對(duì)象。② 在以培養(yǎng)對(duì)象為生物種類(lèi)的隔離環(huán)境中培養(yǎng)、增殖，獲得這一生物種類(lèi)的細(xì)胞群體。針對(duì)不同微生物的特點(diǎn)，有許多分離方法。應(yīng)用廣的是平板法分離純培養(yǎng)。
（一）、用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)
單個(gè)微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長(zhǎng)、繁殖到一定程度可以形成肉眼可見(jiàn)的、有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞生長(zhǎng)群體，稱(chēng)為菌落（colony）。當(dāng)固體培養(yǎng)基表面眾多菌落連成一片時(shí)，便成為菌苔（lawn）。不同微生物在特定培養(yǎng)基上生長(zhǎng)形成的菌落或菌苔一般都具有穩(wěn)定的特征，可以成為對(duì)該微生物進(jìn)行分類(lèi)、鑒定的重要依據(jù)。大多數(shù)細(xì)菌、酵母菌、以及許多真菌和單細(xì)胞藻類(lèi)能在固體培養(yǎng)基上形成孤立的菌落，采用適宜的平板分離法很容易得到純培養(yǎng)。所謂平板，即培養(yǎng)平板（culture plate）的簡(jiǎn)稱(chēng)，它是指固體培養(yǎng)基倒入無(wú)菌平皿，冷卻凝固后，盛固體培養(yǎng)基的平皿。這方法包括將單個(gè)微生物分離和固定在固體培養(yǎng)基表面或里面。固體培養(yǎng)基用瓊脂或其它凝膠物質(zhì)固化的培養(yǎng)基，每個(gè)孤立的活微生物體生長(zhǎng)、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。常用的分離、培養(yǎng)微生物的固體培養(yǎng)基是瓊脂固體培養(yǎng)基平板。這種由Kock建立的采用平板分離微生物純培養(yǎng)的技術(shù)簡(jiǎn)便易行，100多年來(lái)一直是各種菌種分離的常用手段。
1. 稀釋倒平板法（pour plate method）
先將待分離的材料用無(wú)菌水作一系列的稀釋?zhuān)ㄈ?:10、1:100、1:1,000、1:10,000......），然后分別取不同稀釋液少許，與已熔化并冷卻至50℃左右的瓊脂培養(yǎng)基混合，搖勻后，傾入滅過(guò)菌的培養(yǎng)皿中，待瓊脂凝固后，制成可能含菌的瓊脂平板，保溫培養(yǎng)一定時(shí)間即可出現(xiàn)菌落。如果稀釋得當(dāng)，在平板表面或瓊脂培養(yǎng)基中就可出現(xiàn)分散的單個(gè)菌落，這個(gè)菌落可能就是由一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞繁殖形成的。隨后挑取該單個(gè)菌落，或重復(fù)以上操作數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)。　
2. 涂布平板法（spread plate method）
由于將含菌材料先加到還較燙的培養(yǎng)基中再倒平板易造成某些熱敏感菌的死亡，而且采用稀釋倒平板法也會(huì)使一些嚴(yán)格好氧菌因被固定在瓊脂中間缺乏氧氣而影響其生長(zhǎng)，因此在微生物學(xué)研究中更常用的純種分離方法是涂布平板法。其做法是先將已熔化的培養(yǎng)基倒入無(wú)菌平皿，制成無(wú)菌平板，冷卻凝固后，將一定量的某一稀釋度的樣品懸液滴加在平板表面，再用無(wú)菌玻璃涂棒將菌液均勻分散至整個(gè)平板表面，經(jīng)培養(yǎng)后挑取單個(gè)菌落（圖2-4）。
3. 平板劃線(xiàn)法（streak plate method）
用接種環(huán)以無(wú)菌操作沾取少許待分離的材料，在無(wú)菌平板表面進(jìn)行平行劃線(xiàn)、扇形劃線(xiàn)或其他形式的連續(xù)劃線(xiàn)，微生物細(xì)胞數(shù)量將隨著劃線(xiàn)次數(shù)的增加而減少，并逐步分散開(kāi)來(lái)，如果劃線(xiàn)適宜的話(huà)，微生物能一一分散，經(jīng)培養(yǎng)后，可在平板表面得到單菌落。
4. 稀釋搖管法（dilution shake culture method）
用固體培養(yǎng)基分離嚴(yán)格厭氧菌有它特殊的地方。如果該微生物暴露于空氣中不立即死亡，可以采用通常的方法制備平板，然后置放在封閉的容器中培養(yǎng)，容器中的氧氣可采用化學(xué)、物理或生物的方法清除。對(duì)于那些對(duì)氧氣更為敏感的厭氧性微生物，純培養(yǎng)的分離則可采用稀釋搖管培養(yǎng)法進(jìn)行，它是稀釋倒平板法的一種變通形式。先將一系列盛無(wú)菌瓊脂培養(yǎng)基的試管加熱使瓊脂熔化后冷卻并保持在50℃左右，將待分離的材料用這些試管進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)嚬苎杆贀u動(dòng)均勻，冷凝后，在瓊脂柱表面傾倒一層滅菌液體石蠟和固體石蠟的混合物，將培養(yǎng)基和空氣隔開(kāi)。培養(yǎng)后，菌落形成在瓊脂柱的中間。進(jìn)行單菌落的挑取和移植，需先用一只滅菌針將液體石蠟--石蠟蓋取出，再用一只毛細(xì)管插入瓊脂和管壁之間，吹入無(wú)菌無(wú)氧氣體，將瓊脂柱吸出，置放在培養(yǎng)皿中，用無(wú)菌刀將瓊脂柱切成薄片進(jìn)行觀察和菌落的移植。
（二）、用液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)
對(duì)于大多數(shù)細(xì)菌和真菌，用平板法分離通常是滿(mǎn)意的，因?yàn)樗鼈兊拇蠖鄶?shù)種類(lèi)在固體培養(yǎng)基上長(zhǎng)得很好。然而迄今為止并不是所有的微生物都能在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，例如一些細(xì)胞大的細(xì)菌、許多原生動(dòng)物和藻類(lèi)等，這些微生物仍需要用液體培養(yǎng)基分離來(lái)獲得純培養(yǎng)。
通常采用的液體培養(yǎng)基分離純化法是稀釋法。接種物在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行順序稀釋?zhuān)缘玫礁叨认♂尩男Ч?，使一支試管中分配不到一個(gè)微生物。如果經(jīng)稀釋后的大多數(shù)試管中沒(méi)有微生物生長(zhǎng)，那么有微生物生長(zhǎng)的試管得到的培養(yǎng)物可能就是純培養(yǎng)物。如果經(jīng)稀釋后的試管中有微生物生長(zhǎng)的比例提高了，得到純培養(yǎng)物的機(jī)率就會(huì)急劇下降。因此，采用稀釋法進(jìn)行液體分離，必須在同一個(gè)稀釋度的許多平行試管中，大多數(shù)（一般應(yīng)超過(guò)95%）表現(xiàn)為不生長(zhǎng)。

（三）、單細(xì)胞（孢子）分離

稀釋法有一個(gè)重要缺點(diǎn)，它只能分離出混雜微生物群體中占數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)的種類(lèi)，而在自然界，很多微生物在混雜群體中都是少數(shù)。這時(shí)，可以采取顯微分離法從混雜群體中直接分離單個(gè)細(xì)胞或單個(gè)個(gè)體進(jìn)行培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng)，稱(chēng)為單細(xì)胞（或單孢子）分離法。單細(xì)胞分離法的難度與細(xì)胞或個(gè)體的大小成反比，較大的微生物如藻類(lèi)、原生動(dòng)物較容易，個(gè)體很小的細(xì)菌則較難。
對(duì)于較大的微生物，可采用毛細(xì)管提取單個(gè)個(gè)體，并在大量的滅菌培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)移清洗幾次，除去較小微生物的污染。這項(xiàng)操作可在低倍顯微鏡，如解剖顯微鏡下進(jìn)行。對(duì)于個(gè)體相對(duì)較小的微生物，需采用顯微操作儀，在顯微鏡下進(jìn)行。目前，市場(chǎng)上有售的顯微操作儀種類(lèi)很多，一般是通過(guò)機(jī)械、空氣或油壓傳動(dòng)裝置來(lái)減小手的動(dòng)作幅度，在顯微鏡下用毛細(xì)管或顯微針、鉤、環(huán)等挑取單個(gè)微生物細(xì)胞或孢子以獲得純培養(yǎng)。在沒(méi)有顯微操作儀時(shí)，也可采用一些變通的方法在顯微鏡下進(jìn)行單細(xì)胞分離，例如將經(jīng)適當(dāng)稀釋后的樣品制備成小液滴在顯微鏡下觀察，選取只含一個(gè)細(xì)胞的液體來(lái)進(jìn)行純培養(yǎng)物的分離。單細(xì)胞分離法對(duì)操作技術(shù)有比較高的要求，多限于高度專(zhuān)業(yè)化的科學(xué)研究中采用。

（四）、選擇培養(yǎng)分離

沒(méi)有一種培養(yǎng)基或一種培養(yǎng)條件能夠滿(mǎn)足自然界中一切生物生長(zhǎng)的要求，在一定程度上所有的培養(yǎng)基都是選擇性的。在一種培養(yǎng)基上接種多種微生物，只有能生長(zhǎng)的才生長(zhǎng)，其它被抑制。如果某種微生物的生長(zhǎng)需要是已知的，也可以設(shè)計(jì)一套特定環(huán)境使之特別適合這種微生物的生長(zhǎng)，因而能夠從自然界混雜的微生物群體中把這種微生物選擇培養(yǎng)出來(lái)，盡管在混雜的微生物群體中這種微生物可能只占少數(shù)。這種通過(guò)選擇培養(yǎng)進(jìn)行微生物純培養(yǎng)分離的技術(shù)稱(chēng)為選擇培養(yǎng)分離，是十分重要的，特別對(duì)于從自然界中分離、尋找有用的微生物。在自然界中，除了極特殊的情況外，在大多數(shù)場(chǎng)合下微生物群落是由多種微生物組成的，因此，要從中分離出所需的特定微生物是十分困難的，尤其當(dāng)某一種微生物所存在的數(shù)量與其它微生物相比非常少時(shí)，單采用一般的平板稀釋方法幾乎是不可能分離到該種微生物的。例如，若某處的土壤中的微生物數(shù)量在10８時(shí)，必須稀釋到10-6才有可能在平板上分離到單菌落，而如果所需的微生物的數(shù)量?jī)H為10２-３，顯然不可能在一般通用的平板上得到該微生物的單菌落。要分離這種微生物，必須根據(jù)該微生物的特點(diǎn)，包括營(yíng)養(yǎng)、生理、生長(zhǎng)條件等，采用選擇培養(yǎng)分離的方法。或抑制使大多數(shù)微生物不能生長(zhǎng)，或造成有利于該菌生長(zhǎng)的環(huán)境，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間培養(yǎng)后使該菌在群落中的數(shù)量上升，再通過(guò)平板稀釋等方法對(duì)它進(jìn)行純培養(yǎng)分離。
1. 利用選擇平板進(jìn)行直接分離
主要根據(jù)待分離微生物的特點(diǎn)選擇不同的培養(yǎng)條件，有多種方法可以采用。例如在從土壤中篩選蛋白酶產(chǎn)生菌時(shí)，可以在培養(yǎng)基中添加牛奶或酪素制備培養(yǎng)基平板，微生物生長(zhǎng)時(shí)若產(chǎn)生蛋白酶則會(huì)水解牛奶或酪素，在平板上形成透明的蛋白質(zhì)水解圈。通過(guò)菌株培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)水解圈對(duì)產(chǎn)酶菌株進(jìn)行篩選，可以減少工作量，將那些大量的非產(chǎn)蛋白酶菌株淘汰；再如，要分離高溫菌，可在高溫條件進(jìn)行培養(yǎng)；要分離某種抗菌素抗性菌株，可在加有抗菌素的平板上進(jìn)行分離；有些微生物如螺旋體、粘細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌等能在瓊脂平板表面或里面滑行，可以利用它們的滑動(dòng)特點(diǎn)進(jìn)行分離純化，因?yàn)榛心苁顾鼈冏约汉推渌荒芤苿?dòng)的微生物分開(kāi)?？蓪⑽⑸锶郝潼c(diǎn)種到平板上，讓微生物滑行，從滑行前沿挑取接種物接種，反復(fù)進(jìn)行，得到純培養(yǎng)物。
2. 富集培養(yǎng)
主要是指利用不同微生物間生命活動(dòng)特點(diǎn)的不同，制定特定的環(huán)境條件，使僅適應(yīng)于該條件的微生物旺盛生長(zhǎng)，從而使其在群落中的數(shù)量大大增加，人們能夠更容易地從自然界中分離到所需的特定微生物。富集條件可根據(jù)所需分離的微生物的特點(diǎn)從物理、化學(xué)、生物、及綜合多個(gè)方面進(jìn)行選擇，如溫度、pH、紫外線(xiàn)、高壓、光照、氧氣、營(yíng)養(yǎng)等等許多方面。如采用富集方法從土壤中分離能降解酚類(lèi)化合物對(duì)羥基苯甲酸的微生物的實(shí)驗(yàn)過(guò)程。首先配制以對(duì)羥基苯甲酸為碳源的液體培養(yǎng)基并分裝于燒瓶中，滅菌后將少量的土壤樣品接種于該液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一定時(shí)間，原來(lái)透明的培養(yǎng)液會(huì)變得渾濁，說(shuō)明已有大量微生物生長(zhǎng)。取少量上述培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)液中重新培養(yǎng)，該過(guò)程經(jīng)數(shù)次重復(fù)后能利用對(duì)羥基苯甲酸的微生物的比例在培養(yǎng)物中將大大提高，將培養(yǎng)液涂布于以對(duì)羥基苯甲酸為碳源的瓊脂平板，得到的微生物菌落中的大部分都是能降解對(duì)羥基苯甲酸的微生物。挑取一部分單菌落分別接種到含有及缺乏對(duì)羥基苯甲酸的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，其中大部分在含有對(duì)羥基苯甲酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，而在沒(méi)有對(duì)羥基苯甲酸的培養(yǎng)基中表現(xiàn)為沒(méi)有生長(zhǎng)，說(shuō)明通過(guò)該富集程序的確得到了欲分離的目標(biāo)微生物。通過(guò)富集培養(yǎng)使原本在自然環(huán)境中占少數(shù)的微生物的數(shù)量大大提高后，可以再通過(guò)稀釋倒平板或平板劃線(xiàn)等操作得到純培養(yǎng)物。
富集培養(yǎng)是微生物學(xué)家強(qiáng)有力的技術(shù)手段之一。營(yíng)養(yǎng)和生理?xiàng)l件的幾乎無(wú)窮盡的組合形式可應(yīng)用于從自然界選擇出特定微生物的需要。富集培養(yǎng)方法提供了按照意愿從自然界分離出特定已知微生物種類(lèi)的有力手段，只要掌握這種微生物的特殊要求就行。富集培養(yǎng)法也可用來(lái)分離培養(yǎng)出由科學(xué)家設(shè)計(jì)的特定環(huán)境中能生長(zhǎng)的微生物，盡管我們并不知道什么微生物能在這種特定的環(huán)境中生長(zhǎng)。
（五）、二元培養(yǎng)物
分離的目的通常是要得到純培養(yǎng)。然而，在有些情況下這是做不到的或是很難作到的。但可用二元培養(yǎng)物作為純化培養(yǎng)的替代物。只有一種微生物的培養(yǎng)物稱(chēng)為純培養(yǎng)物，含有二種以上微生物的培養(yǎng)物稱(chēng)為混合培養(yǎng)物，而如果培養(yǎng)物中只含有二種微生物，而且是有意識(shí)的保持二者之間的特定關(guān)系的培養(yǎng)物稱(chēng)為二元培養(yǎng)物。例如二元培養(yǎng)物是保存病毒的有效途徑，因?yàn)椴《臼羌?xì)胞生物的嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生物。有一些具有細(xì)胞的微生物也是嚴(yán)格的其它生物的細(xì)胞內(nèi)寄生物，或特殊的共生關(guān)系。對(duì)于這些生物，二元培養(yǎng)物是在實(shí)驗(yàn)室控制條件下可能達(dá)到的接近于純培養(yǎng)的培養(yǎng)方法。
在自然環(huán)境中，獵食細(xì)小微生物的原生動(dòng)物也很容易用二元培養(yǎng)法在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，培養(yǎng)物由原生動(dòng)物和它獵食的微生物二者組成。例如，纖毛蟲(chóng)、變形蟲(chóng)和粘菌。對(duì)這些生物，二者的關(guān)系可能并不是嚴(yán)格的。這些生物中有些能夠純培養(yǎng)，但是其營(yíng)養(yǎng)要求往往復(fù)雜，制備純培養(yǎng)的培養(yǎng)基很困難、很費(fèi)事。
二、微生物生長(zhǎng)量的測(cè)定
微生物學(xué)研究中常常要進(jìn)行微生物生長(zhǎng)量的測(cè)定，有多種方法用于微生物生長(zhǎng)量的測(cè)定，概括起來(lái)常用的有以下幾種：
（一）直接計(jì)數(shù)法 ( 又稱(chēng)全數(shù)法 )
1 、計(jì)數(shù)器直接測(cè)數(shù)法
取定量稀釋的單細(xì)胞培養(yǎng)物懸液放置在血球計(jì)數(shù)板 ( 細(xì)胞個(gè)體形態(tài)較大的單細(xì)胞微生物，如酵母菌等 ) 或細(xì)菌計(jì)數(shù)板 ( 適用于細(xì)胞個(gè)體形態(tài)較小的細(xì)菌 ) 上，在顯微鏡下計(jì)數(shù)一定體積中的平均細(xì)胞數(shù)，換算出供測(cè)樣品的細(xì)胞數(shù)。
（ 1 ）血球計(jì)數(shù)板及細(xì)胞計(jì)數(shù)
血球計(jì)數(shù)板是一種在特定平面上劃有格子的特殊載片。在劃有格子的區(qū)域中，有分別用雙線(xiàn)和單線(xiàn)分隔而成的方格。其中有以雙線(xiàn)為界劃成的方格 25( 或 16) 格，這種以雙線(xiàn)為界的格子稱(chēng)為中格，其內(nèi)有以單線(xiàn)為界的 16 （或 25 ）小格。因此，用于細(xì)胞計(jì)數(shù)的區(qū)域的總小格數(shù)為：25×16 = 400 。該 400 個(gè)小格排成一正方形的大方格，此大方格的每條邊的邊長(zhǎng)為 1 mm ，故 400 個(gè)小格的總面積為 1mm２。
在進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)前，先取蓋玻片蓋于計(jì)數(shù)方格之上，蓋玻片的下平面與刻有方格的血球計(jì)數(shù)板平面之間留有0.1mm 高度的空隙。含有細(xì)胞的供測(cè)樣品液被加注在此空隙中。加注在 400 個(gè)小格（ 1mm２ ）之上與蓋玻片之間的空隙中的液體總體積應(yīng)為：1.0mm×1.0mm×0.1mm = 0 . 1mm３
一般表示樣品細(xì)胞濃度的單位為：億個(gè) / mL 。因此，在計(jì)數(shù)后，獲得在 400 個(gè)小格中的細(xì)胞總數(shù)，再乘以 10 ４ ，以換算成每 mL 所含細(xì)胞數(shù)。其計(jì)算公式如下：
菌液的含菌數(shù) /mL = 每小格平均菌數(shù)× 400 × 10 000 ×稀釋倍數(shù)
在進(jìn)行具體操作時(shí)，一般取五個(gè)中格進(jìn)行計(jì)數(shù)，取格的方法一般有兩種：① 取計(jì)數(shù)板斜角線(xiàn)相連的 5 個(gè)中格；② 取計(jì)數(shù)板 4 個(gè)角上的 4 個(gè)中格和計(jì)數(shù)板正中央的 1 個(gè)中格。對(duì)橫跨位于方格邊線(xiàn)上的細(xì)胞，在計(jì)數(shù)時(shí)，只計(jì)一個(gè)方格 4 條邊中的 2 條邊線(xiàn)上的細(xì)胞，而另兩條邊線(xiàn)上的細(xì)胞則不計(jì)；取邊的原則是每個(gè)方格均取上邊線(xiàn)與右邊線(xiàn)或下邊線(xiàn)與左邊線(xiàn)。