透射電鏡的基本結(jié)構(gòu)與原理

透射電鏡的基本結(jié)構(gòu)與原理:

電子顯微鏡(electron microscopy，EM) 簡(jiǎn)稱(chēng)電鏡，經(jīng)過(guò)五十多年的發(fā)展已成為生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、化學(xué)、農(nóng)林和材料科學(xué)等領(lǐng)域進(jìn)行科學(xué)研究的重要工具，是人類(lèi)認(rèn)識(shí)自然，特別是研究機(jī)體微細(xì)結(jié)構(gòu)的重要手段，電鏡技術(shù)已成為上述各領(lǐng)域研究工作者應(yīng)掌握的一項(xiàng)基本技能。電鏡的創(chuàng)制者魯斯卡(E.Ruska)教授因而獲得了1986年諾貝爾獎(jiǎng)的物理獎(jiǎng)。

與光鏡相比電鏡用電子束代替了可見(jiàn)光，用電磁透鏡代替了光學(xué)透鏡并使用熒光屏將肉眼不可見(jiàn)電子束成像。電子與物質(zhì)相互作用會(huì)產(chǎn)生透射電子、tan性散射電子、能量損失電子、二次電子、背反射電子、吸收電子、X射線、俄歇電子、陰極發(fā)光和電動(dòng)力等等。

電鏡就是利用這些信息來(lái)對(duì)試樣進(jìn)行形貌觀察、成分分析和結(jié)構(gòu)測(cè)定的。電鏡有很多類(lèi)型，主要有透射電鏡 (transmission electron microscope，TEM) (簡(jiǎn)稱(chēng)透射電鏡)和掃描電鏡 (scanning electron microscope，SEM) (簡(jiǎn)稱(chēng)掃描電鏡)兩大類(lèi)。本文僅討論在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域使用廣泛的透射電鏡和掃描電鏡。

透射電鏡和光學(xué)顯微鏡最基本的原理是相同的，顯微放大過(guò)程基本相似，電鏡的光路和部件術(shù)語(yǔ)基本一樣。不同的是，電鏡的照明源不是可見(jiàn)光而是電子束；透鏡也不是玻璃而是軸對(duì)稱(chēng)的電場(chǎng)或磁場(chǎng)，電鏡的總體結(jié)構(gòu)、成像原理、操作方式等與光學(xué)顯微鏡有著本質(zhì)上的區(qū)別。

　　一、基本結(jié)構(gòu)

透射電鏡由電子光學(xué)系統(tǒng)、真空系統(tǒng)和電子學(xué)系統(tǒng)三大部分組成。

(一)電子光學(xué)系統(tǒng)

電子光學(xué)系統(tǒng)即電鏡的鏡體，基本上是一個(gè)電子透鏡系統(tǒng)，一端是電子源，另一端是觀察和記錄系統(tǒng)，中間是安裝樣品的裝置(圖19-1)。

1． 照明系統(tǒng)　由電子槍和聚光鏡組成。其作用是為成像系統(tǒng)提供一個(gè)亮度高、尺寸小、高穩(wěn)定的照明電子束。

電子槍是電鏡的照明源，由燈絲陰極、柵極 (或稱(chēng)韋氏圓筒)和加速陽(yáng)極組成(圖19-2)。

聚光鏡的作用是將來(lái)自電子槍的電子會(huì)聚到樣品上，通過(guò)它來(lái)控制照明電子束斑大小，電流密度和孔徑角。

2．成像系統(tǒng)　包括樣品室、物鏡、中間鏡和投射鏡（或兩個(gè)中間鏡或兩個(gè)投射鏡構(gòu)成4～5個(gè)透鏡系統(tǒng)）。

（1）樣品室：室內(nèi)有樣品臺(tái)，電鏡的樣品載于載網(wǎng)上，載網(wǎng)放在樣品架(或稱(chēng)樣品筒)上。

（2）物鏡：其作用是形成樣品的第一級(jí)放大像和通過(guò)調(diào)節(jié)物鏡線圈的激勵(lì)電流，相應(yīng)地改變物鏡的焦距從而對(duì)像進(jìn)行聚焦。物鏡是電鏡的最關(guān)鍵部分，由它獲得第一幅具有一定分辨本領(lǐng)的電子放大像。物鏡中任何缺陷都將被成像系統(tǒng)其他透鏡進(jìn)一步放大。因此，電鏡的分辨本領(lǐng)主要取決于物鏡的分辨本領(lǐng)。

（3）中間鏡和投射鏡：中間鏡的作用是把物鏡形成的一次放大像或衍射花樣投射到投射鏡的物平面上，再由投射鏡放大投射到熒光屏上而獲得終像。

投射鏡的作用是把中間鏡形成的二級(jí)放大像再放大投射到熒光屏上，從而形成終像。

3．像的觀察和記錄系統(tǒng)　在投射鏡下面是像的觀察和記錄系統(tǒng)。

在熒光下面是照相暗盒，它和電磁快門(mén)、曝光表組成像的記錄系統(tǒng)，用于把終像拍攝記錄下來(lái)?，F(xiàn)代透射電鏡一般還配備有CCD相機(jī)，實(shí)現(xiàn)數(shù)字化成像，結(jié)合相關(guān)的軟件還可以進(jìn)行圖像的分析處理。

　　二、基本原理

(一) 分辨本領(lǐng)與放大倍數(shù)

分辨本領(lǐng)是指能夠分辨物體上兩點(diǎn)之間的最小距離。光學(xué)顯微鏡與電鏡的分辨率相差達(dá)1000倍，因?yàn)楣忡R的分辨本領(lǐng)受到衍射效應(yīng)的限制。當(dāng)光線從一點(diǎn)出發(fā)透過(guò)顯微鏡時(shí)，所成的像不再是一點(diǎn)而是一個(gè)周?chē)鷰в嘘幱暗墓獍?。如果物體上兩個(gè)質(zhì)點(diǎn)靠得很近，所成的像就可能分辨不清。也就是說(shuō)，光的波動(dòng)性給光學(xué)顯微鏡規(guī)定了一個(gè)分辨本領(lǐng)的限制。光鏡的分辨本領(lǐng)最終只能達(dá)到約為照明波長(zhǎng)的0.4倍。

放大倍數(shù)是指物體經(jīng)過(guò)儀器放大后的像與物的大小之比。放大了的像還可多次放大，但到一定限度后繼續(xù)放大時(shí)便不能增加細(xì)節(jié)，這是分辨本領(lǐng)的限制所致。不能增加圖像細(xì)節(jié)的放大倍數(shù)稱(chēng)為空放大，而與分辨本領(lǐng)相應(yīng)的最高放大倍數(shù)稱(chēng)為有效放大倍數(shù)，為眼的分辨本領(lǐng)與儀器的分辨本領(lǐng)之比。

(二)電子波（束）特性

為了提高顯微鏡的分辨本領(lǐng)，就需要尋找波長(zhǎng)更短的光波作照明。1924年法國(guó)學(xué)者德.布羅依(De.Broglie)等人創(chuàng)立了波動(dòng)力學(xué)，提出了物質(zhì)波的概念，指出高速運(yùn)動(dòng)的粒子不僅具有粒子性，而且具有波動(dòng)性。這個(gè)假設(shè)不久就為電子衍射實(shí)驗(yàn)所證實(shí)。衍射是波動(dòng)的特性，高速運(yùn)動(dòng)的電子能發(fā)生衍射，證明它是一種波。它具有波動(dòng)所具有的共同特征量——波長(zhǎng)、頻率、振幅、相位等，并且服從于波動(dòng)的規(guī)律。

(三)磁透鏡的光學(xué)性質(zhì)和聚焦原理

電鏡實(shí)質(zhì)上是電子透鏡的組合。電子透鏡有靜電透鏡和磁透鏡二種。

磁透鏡的聚焦原理：電子在進(jìn)入磁場(chǎng)后受到磁場(chǎng)(洛倫茲力)作用，使電子束產(chǎn)生兩種運(yùn)動(dòng)——旋轉(zhuǎn)和折射，而電子在磁場(chǎng)中的旋轉(zhuǎn)與折射是各自進(jìn)行的。因此，在討論磁透鏡的聚焦作用時(shí)就可以暫不考慮電子的旋轉(zhuǎn)，這樣，電子在磁透鏡的折射與光通過(guò)玻璃凸透鏡的聚焦作用相似了。正如玻璃凸透鏡可用于放大成像一樣。磁透鏡也能用于放大成像，而且還可以借用幾何光學(xué)中的光線作圖法與術(shù)語(yǔ)，如用焦點(diǎn)、焦距、物距、像距等概念來(lái)描述電子在磁透鏡的運(yùn)動(dòng)軌跡。

　　三、超薄切片技術(shù)

透射電鏡的成像是由一定強(qiáng)度的電子束透過(guò)標(biāo)本而成像。由于電子射線的穿透能力比較低，電鏡又具有很高的分辨率和放大率，因此, 電鏡標(biāo)本需要厚度在0.03～0.05μm的超薄切片，以獲得高分辨的超微結(jié)構(gòu)圖像。

超薄切片制作過(guò)程包括取材、固定、脫水、滲透、包埋、聚合、切片和染色等幾個(gè)環(huán)節(jié)。

（一）取材

取材是超薄切片技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。由于生物組織離體后，細(xì)胞將會(huì)立即釋放出各種水解酶引起細(xì)胞自溶，使細(xì)飽內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。因此，為盡可能避免產(chǎn)生人工假像，取材時(shí)有以下要求：

1． 取材要快，一般要求在1min內(nèi)把組織塊浸入固定液。

2． 組織塊要小，一般切成0.5～1.0mm。

3． 所用固定液及容器須預(yù)冷，以降低離體細(xì)胞內(nèi)水解酶的活性，盡可能減少細(xì)胞自溶。

4． 由于電鏡觀察視野小，具有很大的局限性，所以，選擇部位要準(zhǔn)確可靠。

5． 切割組織的刀、剪必須鋒利干凈，避免拉、鋸、壓等動(dòng)作造成細(xì)胞損傷。

（二）固定

1. 固定的作用 標(biāo)本固定在于：

①破壞細(xì)胞的酶系統(tǒng)，阻止細(xì)胞的自溶；

②穩(wěn)定細(xì)胞物質(zhì)成分，如核酸、核蛋白，糖類(lèi)和脂類(lèi)，使之發(fā)生交聯(lián)，減少或避免抽提作用，以保存組織成分；

③在一些細(xì)胞組分之間以化學(xué)反應(yīng)和物理反應(yīng)建立交聯(lián)，以提供一個(gè)骨架來(lái)穩(wěn)定各種細(xì)胞器的空間構(gòu)型；

④能提供一定的電子反差。

2. 常用的固定劑　理想的固定劑須具備的條件有：

①能迅速滲入組織細(xì)胞內(nèi)，盡快固定細(xì)胞以減少組織自溶；

②能穩(wěn)定細(xì)胞各種結(jié)構(gòu)成分，使其在脫水、滲透及包埋等過(guò)程中不溶解和丟失；

③避免細(xì)胞結(jié)構(gòu)膨脹或收縮，以保證獲得真實(shí)結(jié)構(gòu)的電鏡圖像；

④能保存酶的活性以供電鏡細(xì)胞化學(xué)研究。目前尚未找到一種能滿足上述全部功能的理想固定劑，較理想和常用的固定劑有4氧化鋨、醛類(lèi)、高錳酸鉀等。

（1）4氧化鋨 (Osmium tetroxide)俗稱(chēng)鋨酸，為一種強(qiáng)的氧化劑，呈淺黃色結(jié)晶，其分子式OSO4，熔點(diǎn)41℃，沸點(diǎn)131℃，在水中的溶解度為7.24%(25℃) 。其水溶液為中性，有極大的毒性。

（2）戊二醛(glutaraldehyde)分子式為C5H8O2。市售的戊二醛通常是25%或50％的水溶液，其pH為4.0~5.0, 并保存在低溫處, 且不宜存放時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。

（3）高錳酸鉀是一種強(qiáng)的氧化劑，對(duì)磷脂蛋白類(lèi)有特別良好的固定作用?？捎糜诒Ｗo(hù)細(xì)胞的膜相結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等。尤其是對(duì)神經(jīng)髓質(zhì)效果更為顯著，但對(duì)于胞內(nèi)的顆粒性或纖維狀結(jié)構(gòu)幾乎不能固定。常用于植物葉綠體結(jié)構(gòu)及神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)的研究。

3. 固定方法　目前，用于生物樣品超薄切片技術(shù)的主要固定方法是化學(xué)固定法。采用戊二醛 (或戊二醛+多聚甲醛)固定l～3h后，經(jīng)相應(yīng)的緩沖液沖洗，再用1%鋨酸后固定1～2h。

生物樣品有多種多樣，對(duì)于不同的材料和組織部位，其固定方式是不同的。

（1）浸泡固定：適用于一些能允許在短時(shí)間內(nèi)停止供血而仍保持其功能和結(jié)構(gòu)的器官或組織，以及一些病理檢查的樣品。其方法是經(jīng)解剖 (或手術(shù))盡快從機(jī)體中取出所需組織，并按取材要求，把組織切成小塊，放入小瓶子內(nèi)作常規(guī)雙重固定。

（2）血管灌注固定：適用于取材較復(fù)雜或?qū)θ毖踺^敏感的器官或組織，須采用血管灌注固定?？筛鶕?jù)動(dòng)物的大小選用全身灌注或局部灌注的方式。

（3）培養(yǎng)細(xì)胞的固定：如所固定材料為微生物、單細(xì)胞原生動(dòng)物、細(xì)胞提取物或組織培養(yǎng)的細(xì)胞，則應(yīng)先離心倒去上面的培養(yǎng)液 (或上清液)，然后才按常規(guī)方法進(jìn)行雙重固定。戊二醛固定時(shí)間為15～30min，鋨酸固定時(shí)間為15～40min。

對(duì)于試管或培養(yǎng)瓶培養(yǎng)的單層細(xì)胞，在傾去培養(yǎng)液后，即加入前固定液，并輕刮下細(xì)胞，用2000r/min離心15～20min，使細(xì)胞成團(tuán)。然后傾去上清液，再緩慢加入新鮮的前固定液，以免將細(xì)胞團(tuán)沖散，并繼續(xù)進(jìn)行雙重固定。

4. 固定時(shí)注意事項(xiàng)

（1）固定液的濃度：固定液濃度要適宜。一般戊二醛常用濃度為1％～4％,鋨酸為1％～2％。

（2）固定液的滲透壓：固定液的滲透壓須調(diào)節(jié)到接近組織、細(xì)胞的生理值。固定液的滲透壓是通過(guò)改變緩沖液的濃度或者通過(guò)增加鈉、鈣和鎂等電解質(zhì)或葡萄糖和蔗糖等非電解質(zhì)來(lái)調(diào)節(jié)的。

（3）固定液的pH值：固定液pH值須接近所要固定組織的pH值。由于大部分動(dòng)物組織的平均pH值約7.4, 因此，電鏡固定液的pH值都選用中性 (7.2～7.4)。

（4）固定時(shí)的溫度 理論上，低溫能降低酶的活性，減少細(xì)胞自溶和胞內(nèi)物質(zhì)的抽提，因此，大部分樣品宜在0℃～4℃下固定。

（三）脫水

脫水是指用適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑取代組織細(xì)胞中的游離水，因水分的存在會(huì)使組織結(jié)構(gòu)在電鏡高真空狀態(tài)下急劇收縮而遭破壞，另外包埋劑是非水溶性的，細(xì)胞中的游離水會(huì)影響包埋劑的浸透，因此，脫水是一個(gè)很重要的步驟。

1. 常用脫水劑 常用脫水劑有乙醇、丙酮和過(guò)渡液環(huán)氧丙烷等。其中，因乙醇引起細(xì)胞中脂類(lèi)物質(zhì)的抽提較丙酮少，且不使組織材料變硬、變脆，為常用脫水劑。但乙醇不易和用于包埋的環(huán)氧樹(shù)脂相混溶，為此在轉(zhuǎn)入包埋劑前，要用“中間脫水劑”——環(huán)氧丙烷過(guò)渡，它比乙醇和丙酮易與環(huán)氧樹(shù)脂混溶，且揮發(fā)快，利于浸透和包埋。

2. 脫水的原則和方法　生物樣品中的水分占據(jù)著一定空間，急劇脫水會(huì)引起細(xì)胞收縮，必須采用“等級(jí)系列脫水法”，即用逐級(jí)加大脫水劑的濃度逐步把水分置換出來(lái)。一般標(biāo)本在30%、50%、70%、80%、90%、95%乙醇或丙酮停留5～10min，100％乙醇或丙酮3次，每次10～15min。

室內(nèi)相對(duì)濕度要在50%以下。根據(jù)標(biāo)本本身結(jié)構(gòu)致密程度或特殊需要，可適當(dāng)延長(zhǎng)或縮短脫水時(shí)間，選擇合適的起始濃度或增加脫水系列的等級(jí)。

用100%乙醇或丙酮脫水時(shí)，必須先用無(wú)水硫酸銅或用無(wú)水氧化鈣吸收脫水劑中的水分，以保證組織細(xì)胞充分*脫水。另外脫水時(shí)間不可過(guò)長(zhǎng)，以盡量減少細(xì)胞成分的抽提和丟失。

（四）滲透與包埋

滲透和包埋的目的是取代活組織中的水分以及支持整個(gè)結(jié)構(gòu)，以便標(biāo)本有特定的機(jī)械性利于切片。

1. 常用包埋劑及配方　包埋劑種類(lèi)頗多，目前普遍使用的是環(huán)氧樹(shù)脂。為改善包埋塊的切割性能，有時(shí)在環(huán)氧樹(shù)脂包埋劑配方中再加一些增塑劑，以調(diào)節(jié)包埋塊的韌性。

環(huán)氧樹(shù)脂包埋劑對(duì)細(xì)胞微細(xì)結(jié)構(gòu)有較好的保存性能，聚合后體積收縮率較小，為2％～5％，而且在真空中能經(jīng)受較長(zhǎng)時(shí)間的轟擊。但它操作不大方便，反差較弱。

環(huán)氧樹(shù)脂的型號(hào)較多，常用Epon812、Spur樹(shù)脂(ERL-4206) 、TAAB812，還有國(guó)產(chǎn)的環(huán)氧樹(shù)脂618和600等。

2. 滲透與包埋步驟　樣品在*脫水后，即可進(jìn)入滲透。第一步是將樣品置于100％脫水劑及等量包埋劑的混合液中(室溫下30min或數(shù)h)；第二步是將樣品置于純包埋劑中(室溫6h或過(guò)夜),然后可行包埋: 將滲透后的樣品挑入已裝有包埋劑的多孔橡膠模板中，將包埋劑灌滿，放入標(biāo)簽，然后根據(jù)包埋劑聚合時(shí)所需的溫度及時(shí)間聚合，制成包埋塊。

（五）超薄切片

超薄切片的最大面積為0.5mm×0.5mm左右，要切出較理想的超薄切片，不僅超薄切片機(jī)質(zhì)量好，還要有滲透、包埋好的包埋塊，以及要有好的切片刀和操作者技術(shù)熟練等。其步驟是：

1. 定位、修塊　定位、修塊是指保留要進(jìn)行電鏡觀察部分，把其余部分削去，以利進(jìn)行超薄切片。

2. 制刀　用于超薄切片有鉆石刀和玻璃刀。玻璃刀因價(jià)格低廉而被常用。

玻璃刀經(jīng)檢查后的刀還須在刀上作一小水槽，以便在切片時(shí)讓切下來(lái)的超薄切片漂浮在液面上。為防止漏水，邊沿須用石蠟或指甲油焊封。在焊接時(shí)，應(yīng)注意刀刃不要粘上石蠟或其他的焊封劑，以免損傷刀刃。

3. 載網(wǎng)和支持膜制備　超薄切片須置于一種載網(wǎng)上才能進(jìn)行觀察。載網(wǎng)一般采用很薄的銅片，此外，還有鎳網(wǎng)、銀、鉬、不銹鋼、尼龍等材料制成的載網(wǎng)。

（六）超薄切片機(jī)

超薄切片機(jī)有熱膨脹式和機(jī)械進(jìn)刀式兩類(lèi)，后者較常用，它是以微動(dòng)螺旋和微動(dòng)杠桿來(lái)提供微小進(jìn)刀而切出切片，如Leica超薄切片機(jī)。

（七）切片染色

（1）染色的作用：所謂電子染色是利用某些金屬鹽(如鉛、鈾、鋨等)能與細(xì)胞的某些結(jié)構(gòu)和成分結(jié)合，以增加其電子散射能力，進(jìn)而達(dá)到提高反差的一種方法，不同結(jié)構(gòu)成分上吸附有不同數(shù)量重金屬原子，結(jié)合重金屬原子較多的區(qū)域(即結(jié)構(gòu)致密、原子序數(shù)高的部分)具有較強(qiáng)的電子散射能力，在電鏡下呈現(xiàn)為電子致密的黑色；結(jié)合重金屬原子較少的區(qū)域則為淺黑色，灰黑色，沒(méi)有結(jié)合重金屬的區(qū)域是電子透明的區(qū)域，因此，經(jīng)過(guò)電子染色處理可提高樣品反差，增加圖像清晰度。

（2）電子染色劑：

1）醋酸鈾：也稱(chēng)醋酸雙氧鈾，是廣泛使用的染色劑，它以提高核酸、蛋白質(zhì)和結(jié)締組織纖維的反差為主，對(duì)膜染色效果較差。

2）檸檬酸鉛：目前使用*泛的電鏡染色劑，密度大，對(duì)各種組織結(jié)構(gòu)都有廣泛的親和作用，尤以提高細(xì)胞膜系統(tǒng)及脂類(lèi)物質(zhì)的反差為好，對(duì)不能被鋨酸染色的糖原更具有染色作用。

（3）染色的方式：由于鈾和鉛具有不同的染色特征，所以目前切片普遍都采用雙重染色。即先用醋酸鈾染色后，再用檸檬酸鉛染色，相互補(bǔ)充，從而獲得較佳的染色效果。

　　四、免疫電鏡技術(shù)

免疫電鏡技術(shù)是把免疫化學(xué)技術(shù)與電鏡技術(shù)有機(jī)的結(jié)合，用高電子密度的標(biāo)記物(如鐵蛋白、金等)或用經(jīng)細(xì)胞化學(xué)方法處理后達(dá)到電子密度升高的標(biāo)記物 (常用辣根過(guò)氧化物酶或酸性磷酸酶等)標(biāo)記抗體、與組織中的相應(yīng)抗原結(jié)合, 并用電鏡觀察的一種技術(shù)。現(xiàn)在，免疫電鏡技術(shù)已廣泛地應(yīng)用于生物、醫(yī)學(xué)各個(gè)研究領(lǐng)域，使結(jié)構(gòu)與功能研究融為一體。

（一）鐵蛋白標(biāo)記技術(shù)

鐵蛋白標(biāo)記是一種最基本的免疫電鏡技術(shù),曾廣泛用于檢測(cè)病毒和細(xì)胞膜表面的抗原，具有抗原抗體反應(yīng)性好，能較正確地觀察抗原分布等優(yōu)點(diǎn)。

（二）免疫酶技術(shù)

將酶和抗體結(jié)合，但這種酶-抗體結(jié)合物仍然保持該抗體和酶的活性，結(jié)合物中的抗體與相應(yīng)組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原特異性結(jié)合，形成不溶性復(fù)合物，然后通過(guò)相應(yīng)的組織化學(xué)方法將酶顯示出來(lái), 稱(chēng)免疫酶技術(shù)。

用于標(biāo)記抗體的酶有辣根過(guò)氧化物酶 (HRP)、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、細(xì)胞色素C、微過(guò)氧化物酶 (microperoxidase)等，常用的是HRP。

1. 酶標(biāo)記抗體法

（1）直接法：用酶標(biāo)識(shí)的特異性抗體直接與標(biāo)本中的相應(yīng)抗原反應(yīng)結(jié)合，再進(jìn)行酶與底物反應(yīng)，終產(chǎn)物沉淀在抗原抗體反應(yīng)部位。該法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便、快速、特異性強(qiáng)。缺點(diǎn)是對(duì)于所顯示的抗原，必須將其相應(yīng)的特異抗體分別進(jìn)行標(biāo)記，在很大程度上限制了本法的應(yīng)用。

（2）間接法：依次先后使用兩種不同的抗體，先使用未經(jīng)標(biāo)記的特異性抗體即第1抗體，后者與標(biāo)本中的抗原反應(yīng)。然后使用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的第2抗體，最后酶與底物反應(yīng)，生成沉淀。第2抗體是抗第1抗體的抗體。間接法的優(yōu)點(diǎn)在于：即同一種酶標(biāo)記抗體，可與多種1抗配合，檢測(cè)多種抗原。

2. 非標(biāo)記抗體酶法（PAP法） 具有特異性強(qiáng)、敏感度高等優(yōu)點(diǎn)。

該法首先用HRP免疫動(dòng)物制備高效價(jià)的抗酶抗體，HRP通過(guò)免疫反應(yīng)形成免疫復(fù)合物(PAP復(fù)合物)，因此，它不僅保留了酶的活性而且也保存了抗體的活性，PAP復(fù)合物是通過(guò)兩級(jí)抗體與組織細(xì)胞內(nèi)抗原結(jié)合的，第一級(jí)抗體為特異性抗體，能與組織中某種抗原特異性結(jié)合；第二級(jí)抗體是聯(lián)系抗體，它的兩個(gè)Fab段能分別與特異性抗體(一抗)和PAP復(fù)合物的Fc段相結(jié)合，所以，要求特異性抗體和PAP復(fù)合物抗血清必須來(lái)源于同一種動(dòng)物。

PAP復(fù)合物與抗原結(jié)合后還要進(jìn)行呈色反應(yīng)和鋨化，生成電子密度較高的鋨黑，以利電鏡觀察。PAP法有包埋前染色和包埋后染色。

（三）免疫金探針技術(shù)

膠體金是指1～150nm金微粒分散在水溶液中組成的金溶膠，它是一種疏水的膠體，帶負(fù)電荷。用于免疫細(xì)胞化學(xué)的膠體金微粒直徑一般為5～60nm，均呈紅色，直徑超過(guò)100nm或穩(wěn)定性受到破壞形成凝集物皆呈藍(lán)色。免疫金探針技術(shù)包括“包埋前”染色法和“包埋后”染色法?！?/span>

1. 實(shí)驗(yàn)一 蛋白標(biāo)記抗體的應(yīng)用　用于細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)部相應(yīng)抗原的定位和定性。

細(xì)胞內(nèi)抗原觀察的方法如下：

①將待檢組織切成3～5mm的小塊，浸入5%福爾馬林，4℃條件下固定30～60min;

②冷PBS充分洗滌 (10min以上);

③將組織塊在干冰丙酮或液氮中速凍，室溫中融化，重復(fù)3次;

④用振動(dòng)切片機(jī)將組織塊切成50μm的厚片;

⑤將厚片浸在兔抗人球蛋白抗體溶液中;

⑥大量冷PBS在4℃下充分洗滌，至少30min，中間換洗滌液3次,邊攪拌邊洗滌;

⑦組織浸入鐵蛋白標(biāo)記抗體溶液中，置室溫30～60min;

⑧重復(fù)⑥；

⑨切片用1% 4氧化鋨固定30min;

⑩梯度丙酮或酒精脫水;{11}常規(guī)包埋，超薄切片，2%雙重染色，電鏡觀察。

為了確定方法的特異性，必須做對(duì)照實(shí)驗(yàn),較常用的是將標(biāo)本用未標(biāo)記的抗體處理，30min后洗滌，再用該抗體的鐵蛋白標(biāo)記物孵育，使標(biāo)本在電鏡下呈陰性結(jié)果。

2. 實(shí)驗(yàn)二 包埋后染色PAP法　

①新鮮組織經(jīng)固定后 (勿用OsO4后固定)，梯度乙醇脫水，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，超薄切片。

②用鑷網(wǎng)撈片置于5% H2O2溶液中刻蝕3min后用生理鹽水洗。

③正常羊血清1:30(用0.1MPBS稀釋pH7.4)室溫5min。

④兔抗血清(用0.1MPBS,pH7.4)內(nèi)含l%正常羊血清，4℃冰箱內(nèi)處理48h，然后用TBS漂洗。

⑤正常血清1:30室溫5min。

⑥羊抗兔IgG l:10 (用0.1MPBS稀釋)室溫30min后用TBS洗滌。

⑦正常羊血清 (1:30)室溫5min。

⑧兔PAP復(fù)合物 (內(nèi)含l%正常羊血清)，室溫5min后用TBS洗滌。

⑨DAB·4HCl/H2O2 (0.0125%/0.0025%))室溫15min后用0.1MPBS洗。

⑩1% OsO4后固定10～15min。水洗后用醋酸鈾單染或不染。電鏡觀察。

對(duì)照實(shí)驗(yàn)：吸收實(shí)驗(yàn)是將足量的抗原如P物質(zhì)加入抗P物質(zhì)的血清內(nèi)，離心取其上清液，用這樣的血清代替一抗，結(jié)果應(yīng)為陰性;替換試驗(yàn)是用正常血清為第一抗體，結(jié)果為陰性。

3. 實(shí)驗(yàn)三 組織免疫金“包埋后”染色　

①取適當(dāng)固定（按免疫固定方法固定）的新鮮組織，經(jīng)常規(guī)脫水、浸透、包埋（Epon812或低溫包埋劑），制成電鏡樣品塊；

②將60～80nm的超薄切片收集在鎳網(wǎng)上，空氣干燥；

③將干燥后切片置于1%～10% H2O2中處理1～10min(根據(jù)環(huán)氧樹(shù)脂硬度調(diào)H2O2濃度）；

④雙蒸水洗3次，每次5min；

⑤0.1M PBS （pH7.4）（內(nèi)含0.5% Tritonx-100）洗3次，每次5min；

⑥置1%EA（PAG）或1∶5的正常羊血清（SARG）處理20min；⑦加適當(dāng)稀釋一抗，4℃20h，室溫2h；

⑧用0.1M PBS （pH7.4），洗3次。每次10min；

⑨加入1% EA（PAG）或1∶5正常羊血清（SARG），10min；

⑩適當(dāng)稀釋的PAG，室溫2h；{11}0.1M PBS （pH7.4），浸洗3次。每次10min；{12}雙蒸水洗3次，每次5min；{13}常規(guī)鈾、鉛染色，電鏡觀察。

　　五、負(fù)染色技術(shù)

負(fù)染色又稱(chēng)陰染色，是相對(duì)于普通染色（稱(chēng)正染色）而言。所謂負(fù)染，是指通過(guò)重金屬鹽加強(qiáng)樣品外周的電子密度，使樣品顯示負(fù)的反差，襯托出樣品的形態(tài)和大小。

在超薄切片的染色中，染色后的樣品結(jié)構(gòu)的電子密度因染色而被加強(qiáng)，在圖像中呈現(xiàn)黑色。而背景因未被染色而呈光亮。這種染色稱(chēng)為正染色。而在負(fù)染色中則相反，由于染液中某些電子密度高的物質(zhì)(如重金屬鹽等)“包埋”低電子密度的樣品，結(jié)果在圖像中背景是黑暗的，而樣品像“透明”的光亮。兩著之間的反差正好相反，故稱(chēng)為負(fù)染色。

對(duì)顆粒狀的生物材料的研究而言，負(fù)染色技術(shù)較之超薄切片方法具有分辨率高(可達(dá)15?魡) 、簡(jiǎn)單快速等優(yōu)點(diǎn)。因此在生物學(xué)研究中得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用,可以顯示生物大分子、細(xì)菌、病毒、分離的細(xì)胞器以及蛋白質(zhì)晶體等樣品的形狀、結(jié)構(gòu)、大小以及表面結(jié)構(gòu)的特征,尤其在病毒學(xué)中，負(fù)染色技術(shù)成為不可取代的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。

（一）負(fù)染色液的制備

用作負(fù)染色的物質(zhì)應(yīng)具有：

①較強(qiáng)的電子散射能力以產(chǎn)生足夠的圖像反差；

②熔點(diǎn)高，在電子束的轟擊下不會(huì)升華；

③溶解度大，不易析出沉淀；

④在電鏡下不呈現(xiàn)出可觀察到的結(jié)構(gòu)；

⑤分子小，易滲入不規(guī)則表面的凹陷處；

⑥與樣品不起化學(xué)反應(yīng)等。目前常用的負(fù)染液是磷鎢酸(PTA)、磷鎢酸鉀(KPT)和磷鎢酸鈉(NaPT)。此外，醋酸鈾、甲酸鈾、硅鎢酸、鉬酸銨等也常作負(fù)染色劑用。

（二）染色方法

1. 懸滴法　用一根細(xì)滴吸管吸一滴樣品懸液滴在有膜的銅網(wǎng)上，滴樣時(shí)要防止銅網(wǎng)被液體吸到管上來(lái)或翻轉(zhuǎn)而被污染。滴液后靜置數(shù)分鐘。然后用濾紙從銅網(wǎng)邊緣吸去多余的液體，滴上負(fù)染色液，染色1～2min用濾紙吸去負(fù)染色液，再用蒸餾水滴在銅網(wǎng)上洗1～2次，用濾紙吸去水，待干后可用于電鏡觀察。

2. 噴霧法　將染色液和懸液樣品等量混合，帶特制的噴霧器噴到有膜的銅網(wǎng)上，待干可用于電鏡觀察。

3. 漂浮法　先將帶有支持膜的銅網(wǎng)在懸液樣品的液滴上漂浮(有支持膜的那面向下)，然后再在負(fù)染色液的液滴上漂浮。

（三）操作的注意事項(xiàng)

1. 懸液樣品的純度　待染色的懸液樣品如果雜質(zhì)太多將會(huì)干擾染色反應(yīng)和電鏡的觀察，因此樣品必須進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶峒儭?/span>

2. 懸液樣品的濃度 第一次制樣時(shí)，同時(shí)幾種濃度樣品進(jìn)行滴樣，從而選取濃度適中者進(jìn)行觀察。濃度太低時(shí)電鏡下尋找樣品很困難; 濃度過(guò)高，可因樣品的堆集而影響觀察。

3. 樣品和染色液的均勻分布問(wèn)題 生物大分子樣品或病毒樣品最好使用碳膜作支持膜，使用其他支持膜，在電鏡觀察時(shí)往往會(huì)發(fā)生樣品漂移，而不能拍攝。但是由于碳膜的疏水性會(huì)使樣品及染色液凝集。在電鏡觀察時(shí)往往由于樣品和染色劑濃密的堆集而無(wú)法看清樣品的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)。為提高染色效果，需要設(shè)法使樣品和染液均勻分散，可采用以下方法。

（1）使用分散劑:常用分散劑有牛血清蛋白(BSA)，適用于高度純化的顆粒性懸液；也可以用桿菌肽，用作沉淀物的稀釋液；或?qū)悠窇乙?、PTA和桿菌肽溶液三者等量混合后滴樣。

（2）對(duì)碳膜進(jìn)行親水性處理:把覆蓋在銅網(wǎng)上的碳膜放在離子濺射儀中，在10Pa～1Pa的真空中用離子轟擊(蝕刻)幾秒鐘，碳膜即由疏水性變?yōu)橛H水性，為防止其重新變回疏水性，最好于親水性處理后即行使用。

（3）樣品懸液和染色液的酸堿度問(wèn)題:樣品懸液和染色液的酸堿度會(huì)對(duì)負(fù)染色的結(jié)果產(chǎn)生較大的影響。為了確保生物樣品有足夠的緩沖條件，一般用2%醋酸氨或硫酸氨作緩沖液效果較好，并且使懸液的酸堿度呈中性或稍偏酸為宜。

（4）負(fù)染色的時(shí)機(jī):染色時(shí)機(jī)十分重要。滴染色液一般既不要在生物樣品*干了之后,更不要在載網(wǎng)上尚有肉眼可見(jiàn)的水珠時(shí)就著手染色。恰當(dāng)?shù)臅r(shí)機(jī)應(yīng)是用濾紙吸去懸液之后稍待片刻，當(dāng)肉眼看不出殘留的液體時(shí)滴加染色液。如果載網(wǎng)上尚有懸液殘存時(shí)就進(jìn)行染色，或者*干后再染色效果都不佳。

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