流式細(xì)胞儀工作原理

流式細(xì)胞儀工作原理 

流式細(xì)胞術(shù)是一種細(xì)胞分析技術(shù)，它在20世紀(jì)50年代被用于測量細(xì)胞體積，可在細(xì)胞隨快速流動的流體直線通過觀察孔時進(jìn)行檢測。從那時起，許多工程師和研究人員不斷創(chuàng)新，最終帶來了現(xiàn)代流式細(xì)胞儀。在流式細(xì)胞儀中，溶液中的細(xì)胞以每秒10,000個細(xì)胞（或更多）的速度通過儀器的激光束，進(jìn)而對細(xì)胞進(jìn)行檢測。如今的流式細(xì)胞儀具有更多的可檢測熒光參數(shù)（從1或2至最多30個左右或更多），可同時測量同一個細(xì)胞上的所有這些參數(shù)。流式細(xì)胞術(shù)速度快且具有單細(xì)胞水平檢測能力，可為細(xì)胞生物學(xué)家提供統(tǒng)計(jì)學(xué)功能，能夠快速分析和表征數(shù)百萬個細(xì)胞，但無法獲得顯微鏡可提供的形態(tài)特征和亞細(xì)胞定位?？茖W(xué)，就像生活一樣，一切都在于權(quán)衡取舍！請參見表1流式細(xì)胞術(shù)和顯微鏡技術(shù)的對比。

表 1.流式細(xì)胞術(shù)和熒光顯微成像作為細(xì)胞分析技術(shù)的對比。

流式細(xì)胞術(shù)的潛在應(yīng)用

流式細(xì)胞術(shù)的潛在應(yīng)用非常多，包括檢測和測量：

• 蛋白質(zhì)表達(dá) - 遍及所有細(xì)胞，包括細(xì)胞核內(nèi)
• 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)譯后修飾 - 包括剪切和磷酸化蛋白質(zhì)
• RNA - 包括IncRNA、 miRNA和mRNA轉(zhuǎn)錄物
• 細(xì)胞健康狀態(tài) - 從存活率到晚期凋亡或程序化細(xì)胞死亡
• 細(xì)胞周期狀態(tài) - 是評估細(xì)胞處于G0/G1期、S期、G2期或多倍體狀態(tài)的強(qiáng)大工具，包括分析細(xì)胞凋亡和活化
• 鑒定和表征異質(zhì)樣本中的不同細(xì)胞亞群 - 包括區(qū)分中樞效應(yīng)記憶細(xì)胞和耗竭T細(xì)胞或調(diào)節(jié)性T細(xì)胞

分選用流式細(xì)胞儀還可以分選細(xì)胞并回收細(xì)胞亞群以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。這種專業(yè)流式細(xì)胞儀又被稱為熒光激活細(xì)胞分選儀（FACS），這一術(shù)語有時會與“流式細(xì)胞儀”混淆。然而，這種用法是錯誤的。流式細(xì)胞儀是不能進(jìn)行細(xì)胞分選的分析儀器。細(xì)胞分選儀利用與流式細(xì)胞儀相似的流體學(xué)和熒光成分，但是能夠?qū)愘|(zhì)樣品中的特定細(xì)胞群體轉(zhuǎn)移到獨(dú)立試管中，這通常是基于特定的熒光標(biāo)記特性。如果是在無菌條件下進(jìn)行收集，則這些細(xì)胞可用于進(jìn)一步的培養(yǎng)、操作和研究。

流式細(xì)胞術(shù)工作原理概述

流式細(xì)胞儀的三個主要元件是流體學(xué)、光學(xué)和電子學(xué)系統(tǒng)（圖1）。

• 流式細(xì)胞儀的流體系統(tǒng)負(fù)責(zé)將樣品從樣品管轉(zhuǎn)移到流動池。一旦通過流動池（并通過激光束），樣品將被分選出來（在細(xì)胞分選儀中）或移到廢液中。
• 光學(xué)系統(tǒng)的元件包括激發(fā)光源、透鏡和濾光片（用于收集和移動儀器周圍的光）以及用于產(chǎn)生光電流的檢測系統(tǒng)。
• 電子系統(tǒng)是流式細(xì)胞儀的大腦。在這里，來自檢測器的光電流經(jīng)過數(shù)字化、處理和保存，以用于后續(xù)分析。 

樣品上樣到儀器

典型的實(shí)驗(yàn)從單細(xì)胞懸浮液中的熒光標(biāo)記細(xì)胞開始，但是可以使用任何顆粒類型的樣品。將樣品置于流式細(xì)胞儀上，樣品被吸到儀器中，細(xì)胞懸浮在一種被稱為鞘液的生理緩沖液。流體系統(tǒng)（管道、泵和閥）將初始樣品懸浮液排列成單列細(xì)胞流（圖2），并使細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀以進(jìn)行分析。

激光檢測點(diǎn)

細(xì)胞與激光發(fā)生相互作用的地方稱為激光檢測點(diǎn)（圖3）。您也可能聽過它的另一個名字“激光攔截”。這是熒光檢測發(fā)生的地方。當(dāng)激光束照射到單個細(xì)胞時，一些光會撞到細(xì)胞內(nèi)的物理結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致光線散射。這種光散射可被測量，并且與相對細(xì)胞大小和細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)相關(guān)。這些測量稱為前向角散射（FSC）和側(cè)角散射（SSC），取決于收集光的位置相對于激光路徑的角度。幾乎同時，來自激光器的光激發(fā)與細(xì)胞相關(guān)的所有熒光團(tuán)，產(chǎn)生熒光發(fā)射。所有這些光被檢測器收集并通過流式細(xì)胞儀的電子元件進(jìn)行處理。通過激光檢測點(diǎn)之后，流體系統(tǒng)會將不需要的細(xì)胞輸送到廢液桶中。在細(xì)胞分選儀中，細(xì)胞將在激光檢測點(diǎn)被分選和輸送到收集管中，以供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

總結(jié)

流式細(xì)胞術(shù)是一種強(qiáng)大的工具，適用于從表型分析到細(xì)胞健康狀態(tài)和存活率的各種細(xì)胞分析應(yīng)用。

流式細(xì)胞術(shù)的兩大優(yōu)點(diǎn)是能夠測定同一樣品上的大量參數(shù)（2-30個或更多），以及能夠在幾秒內(nèi)收集數(shù)百萬個細(xì)胞的信息。

流式細(xì)胞儀有3個主要組成部分，即流體學(xué)、光學(xué)和電子學(xué)系統(tǒng)，它們共同構(gòu)成了完整的細(xì)胞分析系統(tǒng)（圖4）。