細(xì)胞傳代培養(yǎng)詳解（實戰(zhàn)總結(jié)）

細(xì)胞傳代培養(yǎng)詳解（實戰(zhàn)總結(jié)）

1、什么是細(xì)胞培養(yǎng)

培養(yǎng)的細(xì)胞由于細(xì)胞增殖，數(shù)量增加，細(xì)胞難以繼續(xù)生長繁殖，需要進(jìn)行分瓶培養(yǎng)，將培養(yǎng)的細(xì)胞分散，以1:2或1:3以上的比率轉(zhuǎn)移到另外的容器中進(jìn)行培養(yǎng)，即為傳代培養(yǎng)，一般細(xì)胞可傳代10-50代

2、細(xì)胞的貼壁過程

3、培養(yǎng)細(xì)胞的一代生長過程

①潛伏期：細(xì)胞從接種到貼壁生長繁殖的一段時間

二倍體細(xì)胞系該段時間較長，大概為24-96h；連續(xù)細(xì)胞系時間短，大概10-30min

②指數(shù)生長期：細(xì)胞增殖最旺盛時期，此時進(jìn)行細(xì)胞實驗較佳

指數(shù)生長期持續(xù)3-5d后，隨細(xì)胞數(shù)量不斷增多，生長空間日趨減少，細(xì)胞相互接觸匯合成片，呈現(xiàn)接觸抑制。而惡性細(xì)胞則無接觸抑制現(xiàn)象；癌細(xì)胞則由于營養(yǎng)成分的消耗和細(xì)胞代謝產(chǎn)物的影響而發(fā)生密度抑制。

③停滯期：細(xì)胞數(shù)量達(dá)到飽和密度后，細(xì)胞與營養(yǎng)液的交換面積減少，代謝產(chǎn)物積累，pH下降細(xì)胞停止增殖，進(jìn)入停滯期。此時應(yīng)該進(jìn)行細(xì)胞傳代，但是得傳1-2代細(xì)胞才能恢復(fù)。

4、細(xì)胞傳代的一般步驟

a、懸浮細(xì)胞

可采用加入等量新鮮培養(yǎng)基后直接吹打分散進(jìn)行傳代，或用離心法后，加入新培養(yǎng)基后再吹打分散進(jìn)行傳代

b、貼壁細(xì)胞

①實驗準(zhǔn)備，超凈臺噴灑酒精，紫外照射30min。準(zhǔn)備好培養(yǎng)瓶/皿，離心管，10%DMEM，0.25%胰酶，D-hanks液等，帶上手套等

②倒去舊培養(yǎng)基，用D-hanks液清洗一遍，去除沉積的死細(xì)胞等

③加入2ml 0.25％胰蛋白酶消化液，消化2～3min，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞單層收縮突起出現(xiàn)空隙時，倒去酶液。

④加入1～2滴管含有血清的培養(yǎng)液，反復(fù)吹打細(xì)胞，使其成細(xì)胞懸液

⑤以1：2或1：3進(jìn)行分裝，補充新鮮培養(yǎng)基，并在培養(yǎng)瓶上做好標(biāo)記，注明代號、日期，輕輕搖勻，37℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

⑥細(xì)胞培養(yǎng)24h后，即可觀察培養(yǎng)液的顏色及細(xì)胞的生長情況

5注意事項

①傳代培養(yǎng)時要注意無菌操作并防止細(xì)胞之間的交叉污染。所有操作要盡量靠近酒精燈火焰。每次最好只進(jìn)行一種細(xì)胞的操作

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