NEBiolabs的產(chǎn)品介紹

時(shí)間：2024/3/22閱讀：910

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)是當(dāng)下很流行的基因編輯工具，在基礎(chǔ)研究和臨床轉(zhuǎn)化中展現(xiàn)日益強(qiáng)大的實(shí)力。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)由 Cas9 蛋白和單鏈向?qū)?RNA（sgRNA）組成。Cas9 蛋白在 sgRNA 的引導(dǎo)下識(shí)別特定的 DNA 序列，進(jìn)行雙鏈 DNA 切割。因此 CRISPR/Cas9 要實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)序列的切割，必須經(jīng)過(guò)兩重的考驗(yàn)，一是 sgRNA 和靶 DNA 之間堿基配對(duì)，二是靶 DNA 的 3' 端有合適的 PAM 序列。以 SpCas9 為例，其僅能識(shí)別編輯 PAM 序列為 NGG 的基因組位點(diǎn)，因而限制了其應(yīng)用，研究者們一直在嘗試優(yōu)化 Cas9 蛋白，以拓展其對(duì)不同 PAM 序列的兼容性。

Cas9 強(qiáng)勢(shì)升級(jí)-EnGen® SpRY Cas9 核酸酶，基本不受 PAM 序列限制，想剪哪里剪哪里

EnGen® SpRY Cas9 核酸酶克隆自化膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes），是一種經(jīng)過(guò)改造的 DNA 內(nèi)切酶，可在靶向位點(diǎn)特異切割雙鏈 DNA。其靶向切割需要一個(gè)大約 100 nt sgRNA，sgRNA 與雙鏈 DNA 底物的 PAM 序列上游緊鄰的 20 個(gè)核苷酸區(qū)域互補(bǔ)。與野生型 Spy Cas9 的經(jīng)典 5′-NGG-3′ PAM 不同，SpRY Cas9 在體外靶向切割基本上對(duì) PAM 沒(méi)有序列要求，只需要一個(gè) 5′-NNN-3′(1,2) PAM，在 PAM 上游 3 個(gè)核苷酸處進(jìn)行雙鏈切割。EnGen SpRY Cas9 在其編碼蛋白的 C 端帶有 SV40（Simian virus 40）T 抗原核定位序列（NLS）。

優(yōu)勢(shì)一

使用非特異性 PAM（5′-NNN-3′ PAM），消除對(duì)雙鏈 DNA 靶向切割的序列限制

優(yōu)勢(shì)二

在克隆工作流程中成功用于消化大片段質(zhì)粒

優(yōu)勢(shì)三

可與 EnGen sgRNA 合成試劑盒 S.pyogenes (NEB #E3322)， EnGen 突變檢測(cè)試劑盒（NEB #E3321）和 NEBuilder® 高保真 DNA 組裝預(yù)混液（NEB #E2621）聯(lián)合使用

EnGen SpRY Cas9 核酸酶是來(lái)自 S. pyogenes的 Cas9 核酸酶的變體，其 PAM 作用結(jié)構(gòu)域內(nèi)有幾個(gè)點(diǎn)突變（1）。與野生型 Cas9 不同，EnGen SpRY Cas9 不受 NGG PAM 的限制，在體外應(yīng)用中可以在任意三核苷酸序列上游進(jìn)行雙鏈切割。

EnGen® SpRY Cas9 切割靈活性的演示。A）pXba 的示意圖，顯示了限制性內(nèi)切酶 BsrGI 識(shí)別位點(diǎn)。矩形框中包含了 BsrGI 識(shí)別序列，紅色三角形表示切割位點(diǎn)。B）用于靶向 pXba 中 BsrGI 位點(diǎn)的三個(gè) sgRNA 序列。EnGen SpRY Cas9 和 BsrGI 的切割位點(diǎn)均以紅色三角指示。SpRY Cas9 非經(jīng)典 PAMs 以黃色文本表示。C）在 1X NEBuffer r3.1 中，使用 10 units BsrGI 或 1µM EnGen SpRY Cas9 和上述三種 sgRNA（濃度均為1µM）消化 1µg pXba 質(zhì)粒（22563 bp）。所有反應(yīng)在 37°C下溫育 1 小時(shí)，然后在 80°C下溫育 5 分鐘。通過(guò)使用 Agilent gDNA ScreenTape 系統(tǒng)在 4200 TapeStation 儀器上進(jìn)行凝膠電泳，以比較 BsrGI 和 SpRY 消化后產(chǎn)物 DNA 條帶。針對(duì) pXba 質(zhì)粒的 BsrGI 位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)切割， BsrGI 和 SpRYCas9 切割產(chǎn)生了幾乎一致的條帶圖譜。使用濃度低至 50 nM 的 EnGen SpRY Cas9 和 sgRNA對(duì) 1µg pXba 質(zhì)粒進(jìn)行消化，結(jié)果與濃度 1 µM 的相似。未酶切的 pXba 作為對(duì)照進(jìn)行電泳，但是環(huán)狀 DNA 在 gDNA ScreenTape 系統(tǒng)中電泳不能精確地按大小進(jìn)行分離。

在 1X NEBuffer™ r3.1 中，使用 50 nM 的 EnGen SpRY Cas9 和 50 nM 的 sgRNA，在37°C下反應(yīng) 1 小時(shí)，將 1 µg pXba（22,563 bp）在 pVII ORF 起始密碼子的下游進(jìn)行線性化。在繼續(xù) DNA 組裝之前，線性化質(zhì)?？梢赃x擇經(jīng)過(guò)柱純化或不純化。按照推薦方案，使用 NEBuilder 高保真 DNA 組裝試劑盒將編碼核定位信號(hào)（NLS）標(biāo)簽的寡核苷酸插入到pVII中。通過(guò)轉(zhuǎn)化后生長(zhǎng)的克隆數(shù)量，可以定性評(píng)估在 EnGen SpRY Cas9 消化質(zhì)粒后，有多少轉(zhuǎn)化子來(lái)自未消化的質(zhì)粒。雖然不是必需的，但在組裝前對(duì)線性化的 pXba 質(zhì)粒進(jìn)行純化可以減少背景菌落百分比。

產(chǎn)品名稱	貨號(hào)	規(guī)格
EnGen® SpRY Cas9 核酸酶	M0669T/M	500/2,500 pmol

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