α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性檢測試劑盒（微量法）說明書

α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性檢測試劑盒（微量法）

產(chǎn)品貨號：BA1937

產(chǎn)品規(guī)格：100管/48樣

產(chǎn)品簡介：

α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（α-L-Arabinofuranosidase，α-L-Af）屬于糖基水解酶家族，可以從含有阿拉伯糖殘基的多聚物如阿拉伯木聚糖、阿拉伯聚糖和阿拉伯半乳聚糖等的非還原末端水解生成一個L-阿拉伯糖分子。該酶在半纖維素降解以及果實的成熟軟化過程中有著重要作用。

α-L-Af分解對硝基苯基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷生成對-硝基苯酚，對-硝基苯酚在400nm處有最大吸收峰，通過測定400nm處吸光值變化可計算得α-L-Af活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

產(chǎn)品組成：

溶液的配制：

1. 試劑一：臨用前取1支加入1.37mL蒸餾水，充分溶解，用不完的試劑建議分裝后-20℃保存一周，避免反復(fù)凍融。

2. 標準品：5µmol/mL的對-硝基苯酚。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、臺式低溫離心機、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、微量玻璃比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水、EP管。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）:提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取0.1g組織，加入1mL提取液），冰浴勻漿。15000g，4℃離心10min，取上清（若為綠色植物的莖、葉、芽等組織，建議將上清用提取液稀釋5倍后檢測；若為果肉等組織，上清可直接檢測或根據(jù)預(yù)測定結(jié)果稀釋相應(yīng)倍數(shù)后檢測）置冰上待測。

2. 細菌、細胞：先收集細胞或細菌樣本到離心管內(nèi)，離心棄上清后，按照細胞數(shù)量10⁴個：提取液體積（mL） 500~1000:1的比例，建議500萬細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞或細菌（功率200w，超聲3s，間隔7s，總時間3min），然后15000g，4℃，離心10min，取上清，置冰上待測。

3. 液體：直接測定。

二、測定步驟

1. 分光光度計/酶標儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至400nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 將5µmol/mL的對-硝基苯酚標準液用提取液稀釋為500、250、125、62.5、31.25、15.625nmol/mL的標準溶液備用。

3. 操作表 (在1.5mL離心管中) ：

三、α-L-Af活性計算

1. 標準曲線的繪制：

以各個標準溶液的濃度為x軸，其對應(yīng)的ΔA標準為y軸，繪制標準曲線，得到標準方程y＝kx+b，將ΔA帶入方程得到x（nmol/mL）。

2. α-L-Af 活性的計算：

（1）按蛋白濃度計算

酶活定義：每mg蛋白每小時產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚為1個酶活力單位。

α-L-Af 酶活（U/mg prot）= x×V提取÷（V提取×Cpr）÷T=2x÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計算

酶活定義：每g樣本每小時產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚為1個酶活力單位。

α-L-Af 酶活（U/g質(zhì)量）= x×V提取÷W÷T= 2x÷W

（3）按照細胞或細菌數(shù)量計算

酶活定義：每10⁴個細胞每小時產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚為1個酶活力單位。

α-L-Af 酶活（U/10⁴ cell）= x×V提取÷細胞數(shù)量（萬個）÷T= 2x÷細胞數(shù)量（萬個）

（4）按液體體積計算

酶活定義：每mL樣本每小時產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚為1個酶活力單位。

α-L-Af 酶活（U/mL）=x×V樣÷V樣÷T=2x

V提?。禾崛∫后w積，1mL；V樣：加入的樣本體積，0.06mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL，蛋白濃度自行測定；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，0.5h。

注意事項：

1. A或ΔA大于1.2時，建議將樣本用提取液稀釋后再進行測定。

2. 正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定，若濃度過高，建議將樣本用提取液稀釋適當倍數(shù)后再進行測定，并在計算公式中乘以稀釋倍數(shù)；若濃度過低，建議在樣本提取時增加組織質(zhì)量。

3. 加入試劑二后，建議5min內(nèi)讀取OD值。