Trizol(總RNA提取試劑)使用說明書

Trizol(總RNA提取試劑)

產(chǎn)品貨號：T11180

產(chǎn)品規(guī)格：100ml

產(chǎn)品簡介：

Trizol是一種新型的用于細胞或組織的總RNA提取試劑，Trizol采用與Invitrogen TRIzol相似的原理和方法，其顏色、抽提的方法和步驟與后者相同。Trizol含酚和異硫氰酸胍等物質(zhì)，能迅速裂解細胞或組織并且滅活核酸酶，保持RNA的完整性。加入氯仿并離心后，溶液形成上清層為水相(無色)、中間層、下層為有機相(紅色)。上清層用異丙醇沉淀回收總RNA，中間層用乙醇沉淀回收DNA，下層用異丙醇沉淀回收蛋白。

Trizol適用于從各種組織或細胞中快速分離總RNA，既可用于小量樣品(50～100mg組織、5×10⁶細胞)，也可用于大量樣品(>1g組織/>10⁷細胞)。提取的總RNA質(zhì)量高，可用于Northern blot、Dot blot、polyA篩選、體外翻譯、RNase保護分析和分子克隆。本產(chǎn)品具有以下特點：①適用范圍廣；②操作簡單，整個過程1小時內(nèi)完成；③純度高；④污染少。

產(chǎn)品組成：

自備材料：

1. 試劑：無水乙醇、氯仿、異丙醇、DEPC處理水等。

2. 耗材： RNase廣泛存在于人的皮膚上和體液及環(huán)境中，RNase是導致RNA降解的最主要物質(zhì)，非常穩(wěn)定。操作時應佩戴一次性口罩、手套、帽子。塑料制品、玻璃和金屬物品、實驗儀器等應清除RNase，移液器吸頭、EP管等制品的RNase free處理尤為重要。

3. 儀器：低溫高速離心機、低溫冰箱。

操作步驟 (僅供參考) ：

1. 樣品準備

（1）貼壁細胞：

①直接裂解：直接在培養(yǎng)瓶/皿中加入Trizol裂解細胞，每10cm²面積加1ml Trizol，用移液器吹打混勻。

②胰蛋白酶消化：用無菌PBS洗滌細胞后，加入含有0.05～0.25%胰蛋白酶的PBS處理細胞，當細胞脫離容器壁后，加入含有血清的培養(yǎng)基終止反應，將細胞溶液轉(zhuǎn)移至無RNase的離心管中，5000～6000g離心5min，收集細胞沉淀，去除上清。收集細胞時一定要將細胞培養(yǎng)液去除干凈，否則裂解不，降低RNA收獲率。  

（2）懸浮細胞：無需清洗細胞，直接5000～6000 g離心5min，收集細胞。每5×10⁶～10⁷動物、植物和酵母細胞或每10⁷細菌細胞加入1ml Trizol。

（3）組織：取新鮮動物或者植物組織或者-70℃凍存組織，50～100mg組織在液氮中充分研磨或者加入1ml Trizol研磨或者用勻漿器勻漿處理。樣品體積一般不超過Trizol體積的10%。研磨要迅速，以1min為佳。

（4）血液：取0.5～1 ml新鮮或凍存的血液，12000g離心5min，去除血漿，加入1ml Trizol，充分振蕩混勻。

2. 核酸分離：充分振蕩混勻(可以置于低溫/超低溫冰箱凍存5～10min后，充分振蕩，反復1～3次)，將裂解樣品或勻漿液室溫放置5～10min，使核蛋白與核酸分離。

3. 樣品分層：加入0.2ml氯仿/1ml Trizol，劇烈振蕩15s，室溫放置2～3min。置于4℃離心機，12000g離心10～15 min。上層為水相，中間層和下層為有機相，RNA在上層水相。

4. 沉淀RNA：吸取上層水相(約500μl)轉(zhuǎn)移至無RNase的離心管中(不要吸取任何中間層物質(zhì),否則會有染色體DNA污染)，加入等體積異丙醇混勻(或者加入1.2倍體積Trizol專用RNA沉淀液，超低溫冰箱放置2～3hr,可以大大提高RNA回收率），室溫放置15～20 min。12000 g 4℃離心10min，離心后管側(cè)或管底形成膠狀沉淀，棄上清。

5. 洗滌RNA：加入1ml DEPC水配制的75%乙醇/1ml Trizol洗滌沉淀(或者加入1ml Trizol專用RNA洗滌液，可以大大提高RNA純度），室溫放置5～10 min，7500g 4℃離心5min，棄上清。室溫干燥5～10 min，不宜過分干燥，否則RNA難以溶解。

6. 溶解RNA：加入30～50ul RNase-free ddH2O充分溶解RNA，-70℃長期保存或直接用于后續(xù)試驗。對于肝、胰腺、腎等組織中RNase含量高的樣品，沉淀時用100%去離子甲酰胺溶解。

分析與定量：

1. 測定樣品在260nm和280nm的吸收值確定RNA的質(zhì)量。按1OD=40pg RNA計算RNA的產(chǎn)率。OD260/280在1.8～2.0視為抽提RNA純度較好。濃度在4μg/ml以上的樣品適于用分光光度計測定。

2. 進行甲醛變性瓊脂糖電泳，確定RNA的完整性和污染情況。

3. 核酸分析儀測定RNA的質(zhì)量和純度。

注意事項：

1. 樣品保存：加入Trizol混勻后，樣品可在-70℃放置1～2月；RNA樣品可以在70%酒精中-70℃保存2～4周：如果需要長期保存，應置于超低溫冰箱中保存。

2. Trizol是強腐蝕性物質(zhì)，污染皮膚或眼睛后，立即用清水或生理鹽水沖洗，必要時尋求醫(yī)生的幫助。

3. Trizol可常溫運輸，建議保存4℃保存。

4. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

有效期：12個月有效。

常見問題分析：