SDS裂解液操作步驟：（僅供參考）

SDS裂解液

目錄編號：T16008

產(chǎn)品規(guī)格：100ml

產(chǎn)品簡介：

   多種成分均可以從細(xì)胞中提取總蛋白，例如Triton、SDS、NP-40等。SDS裂解液 (SDS Lysis Buffer)是一種極其強(qiáng)烈的細(xì)胞組織快速裂解液并獲得總蛋白質(zhì)。其裂解液強(qiáng)度大于NP-40裂解液、RIPA裂解液(弱)、RIPA 裂解液(中)、通用細(xì)胞裂解液、Western及IP細(xì)胞裂解液，所獲得的蛋白質(zhì)可以用于Western、染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)等。

尚寶生物 SDS Lysis Buffer主要由Tris-HCl、NaCl、SDS等組成，并含有多種蛋白酶抑制劑成分，可以有效抑制蛋白的降解，并維持原有的蛋白間相互作用。

產(chǎn)品組成：

注：自備PMSF溶液（100mM ）（可參考尚寶P2010）。

操作步驟：（僅供參考）

(一)貼壁培養(yǎng)細(xì)胞

1. 取SDS Lysis Buffe室溫溶解混勻，使用前取適量裂解液加入PMSF，使終濃度為1mM。

2. 去除貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液，用PBS、NS或無血清培養(yǎng)液清洗1次，低速離心，棄上清，留取沉淀。

3. 按照6孔板每孔加入150～250μl含有PMSF的裂解液的比例加入SDS Lysis Buffer。移液器輕輕吹打，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。通常裂解液作用于細(xì)胞1～3s 內(nèi)，細(xì)胞就會被裂解。如果是所提蛋白樣品用于CHIP, 應(yīng)置于冰上或4℃裂解15～30min。通常6孔板每孔細(xì)胞加入150μl裂解液已經(jīng)足夠，但如果細(xì)胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到200～250μl。

4. 10000～12000g，4℃離心5～10min(如無低溫離心機(jī)，室溫下離心亦可)，取上清。

5. 進(jìn)行后續(xù)的Western、染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)等操作。

(二)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞

1. 取SDS Lysis Buffer置于室溫溶解混勻后，使用前取適量裂解液加入PMSF，使其最終濃度為1mM。

2. 低速離心懸浮細(xì)胞，棄上清，收集沉淀。

3. 用手指輕彈細(xì)胞，使其松散。按照6孔板每孔細(xì)胞加入150～250μl含有PMSF的裂解液的比例，加入SDS Lysis Buffer。通常6孔板每孔細(xì)胞加入150μl裂解液已經(jīng)足夠，但如果細(xì)胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到200～250μl。再用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞，充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細(xì)胞沉淀。通常裂解液作用于細(xì)胞1～3s內(nèi)，細(xì)胞就會被裂解。如果是所提蛋白樣品用于 CHIP, 置于冰上或 4℃裂解 15～30min。

4. 10000～12000g，4℃離心 5～10min(如無低溫離心機(jī)，室溫下離心亦可)，取上清。

5. 進(jìn)行后續(xù)的 Western、染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)等操作。

(三)組織樣本

1. 取SDS Lysis Buffer置于室溫溶解混勻，使用前取適量裂解液加入PMSF，使其最終濃度為1mM。

2. 把組織剪切成細(xì)小的碎片，越小越好。

3. 取在液氮或超低溫冰箱中冷凍30min以上的組織，迅速用液氮研磨，研磨過程盡量控制在1～2min之內(nèi)，以減少蛋白的降解。

4. 按20mg組織加入150～250μl裂解液的比例加入含有PMSF的裂解液。冰上或4℃裂解15～30min。如果是所提蛋白樣品用于CHIP,置于冰上或4℃繼續(xù)裂解10～20min。

5. 步驟3、4亦可以采用如下過程：按照每20mg組織加入150～250μl裂解液的比例加入含有PMSF的SDS Lysis Buffer。用玻璃勻漿器或組織研磨器勻漿，直至充分裂解，過程盡量控制1～2min之內(nèi)，以減少蛋白的降解。如果是所提蛋白樣品用于CHIP, 應(yīng)置于冰上或4℃繼續(xù)裂解10～20min。

6. 10000～12000g，4℃離心5～10min(如無低溫離心機(jī)，室溫下離心亦可)，取上清。

7. 進(jìn)行后續(xù)的Western、染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)等操作。

注意事項 ：

1. 去除貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液后，如果血清中的蛋白沒有干擾，可以不用清洗。

2. 如果裂解不充分可以適當(dāng)增加裂解液的用量，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當(dāng)減少裂解液的用量。

3. 在培養(yǎng)細(xì)胞的裂解中，如果細(xì)胞量較多，必需分裝成50-100萬細(xì)胞/離心管，然后再裂解。少量的細(xì)胞由于裂解液容易和細(xì)胞充分接觸，相對比較容易裂解充分。

4. 如果組織樣品本身非常細(xì)小，可以適當(dāng)剪切后直接加入裂解液裂解，通過強(qiáng)烈Vortex使樣品裂解充分。然后同樣離心取上清，用于后續(xù)實驗。直接裂解的優(yōu)點(diǎn)是比較方便，不必使用勻漿器，缺點(diǎn)是不如使用勻漿器那樣裂解得比較充分。

5. 溶解SDS Lysis Buffer時，應(yīng)盡量縮短溶解時間，避免裂解液中的有效成分失效。

6. 細(xì)胞裂解的操作步驟，應(yīng)置于冰上或4℃進(jìn)行。

有效期：12個月有效。