Triton X-100細(xì)胞裂解液 蛋白類 返回列表頁

Triton X-100細(xì)胞裂解液 

產(chǎn)品貨號：T15196

產(chǎn)品規(guī)格：100ml

產(chǎn)品簡介：

Triton X-100細(xì)胞裂解液是一種經(jīng)典的快速裂解細(xì)胞組織并獲得蛋白的裂解液。所獲得的蛋白質(zhì)可以用于 PAGE電泳，Western，免疫沉淀(Immunol Precipitation，IP)和免疫共沉淀(co-IP)等。Triton X-100、NaCl、Tris-HCl 等組成，并含有多種蛋白酶抑制劑成分，可以有效抑制蛋白的降解，并維持原有的蛋白間相互作用。作用原理是利用去污劑Triton X-100 破壞脂質(zhì)雙分子層，溶解胞質(zhì)和細(xì)胞膜，破壞分子間微弱結(jié)合鍵的大部分蛋白質(zhì)抗原。其濃度在0.1%～1%時即可滿足幾乎所有溶解的需求，且可補(bǔ)充等離子濃度的鹽及使pH 接近中性。不宜用 Bradford 法測定由Triton X-100 Lysis Buffer獲得樣本的蛋白濃度。

產(chǎn)品組成：

操作步驟(僅供參考)：

(一)貼壁培養(yǎng)細(xì)胞

• 取Triton X-100 Lysis Buffer 室溫溶解混勻，加入PMSF，使PMSF終濃度為1mM。
• 去培養(yǎng)液，用PBS、NS或無血清培養(yǎng)液清洗1次，低速離心，棄上清，留取沉淀。
• 按照6孔板每孔加入150～250μl含有PMSF的裂解液的比例加入Triton X-100 Lysis Buffer。移液器輕輕吹打，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。置于冰上或4℃裂解，通常裂解液作用于細(xì)胞1～3s內(nèi)，細(xì)胞就會被裂解。通常6孔板每孔細(xì)胞加入150μl裂解液已經(jīng)足夠，但如果細(xì)胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到200～250μl。
• 10000～12000g，4℃離心5～10min(如無低溫離心機(jī)，室溫下離心亦可)，取上清。
• 進(jìn)行后續(xù)的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

(二)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞 

• 取Triton X-100 Lysis Buffer室溫溶解混勻，加入PMSF，使PMSF終濃度為1mM。
• 低速離心懸浮細(xì)胞，棄上清，收集沉淀。
• 用手指輕彈細(xì)胞，使其松散。按照6孔板每孔細(xì)胞加入150～250μl含有PMSF的裂解液的比例，加入尚寶生物Triton X-100 Lysis Buffer 。通常6孔板每孔細(xì)胞加入150μl裂解液已經(jīng)足夠，但如果細(xì)胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到200～250μl。
• 再用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞，充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細(xì)胞沉淀。
• 10000～12000g，4℃離心5～10min(如無低溫離心機(jī)，室溫下離心亦可)，取上清。
• 進(jìn)行后續(xù)的 SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

(三)組織樣本

• 取Triton X-100 Lysis Buffer 室溫溶解混勻后，加入PMSF，使PMSF終濃度為1mM。
• 把組織剪切成細(xì)小的碎片，越小越好。
• 取在液氮或超低溫冰箱中冷凍30min以上的組織，迅速用液氮研磨，研磨過程盡量控制在1～2min之內(nèi)，以減少蛋白的降解。
• 按照每20mg組織加入150～250μl裂解液的比例加入含有PMSF的裂解液。冰上或4℃裂解15～30min。
• 步驟3、4亦可以采用如下過程：按照每20mg組織加入150～250μl裂解液的比例加入含有PMSF的Triton X-100 Lysis Buffer。用玻璃勻漿器或組織研磨器勻漿，直至充分裂解，該過程盡量控制在1～2min之內(nèi)，以減少蛋白的降解。
• 10000～12000g，4℃離心5～10min(如無低溫離心機(jī)，室溫下離心亦可)，取上清。
• 進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

注意事項：

• 去除貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液后，如果血清中的蛋白沒有干擾，可以不用清洗。
• 如果裂解不充分可以適當(dāng)增加裂解液的用量，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當(dāng)減少裂解液的用量。
• 如果細(xì)胞量較多，必需分裝成50～100萬細(xì)胞/離心管，然后再裂解。大團(tuán)的細(xì)胞較難裂解充分，而少量的細(xì)胞由于裂解液容易和細(xì)胞充分接觸，相對比較容易裂解充分。
• 如果組織樣品本身非常細(xì)小，可以適當(dāng)剪切后直接加入裂解液裂解，通過強(qiáng)烈Vortex使樣品裂解充分。然后同樣離心取上清，用于后續(xù)實驗。直接裂解的優(yōu)點是比較方便，不必使用勻漿器，缺點是不如使用勻漿器那樣裂解得比較充分。
• 溶解Triton X-100 Lysis Buffer時，應(yīng)盡量縮短溶解時間，避免有效成分失效。
• 裂解產(chǎn)物中經(jīng)常會出現(xiàn)一小團(tuán)透明膠狀物，屬正常現(xiàn)象。該透明膠狀物為含有基因組DNA等的復(fù)合物。在不檢測和基因組DNA結(jié)合特別緊密的蛋白的情況下，可以直接離心取上清用于后續(xù)實驗。如果需要檢測和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白，則可以通過超聲處理打碎打散該透明膠狀物，隨后離心取上清用于后續(xù)實驗。如果檢測一些常見的轉(zhuǎn)錄因子，例如NF-KB、p53等時，通常不必進(jìn)行超聲處理，就可以檢測到這些轉(zhuǎn)錄因子。
• 細(xì)胞裂解的操作步驟，應(yīng)置于冰上或4℃進(jìn)行。

有效期：12個月有效。